Pierwotna nadczynność przytarczyc i mikroflora jelitowa (HYPOGEUM)

Metody. Projekt zostanie zorganizowany w trzech pakietach roboczych (WP). WP1. Ustal, czy skłonność pacjentów z PHPT do rozwoju utraty masy kostnej można przewidzieć na podstawie składu mikrobiomu kału (miesiąc 0-11). Będziemy przeprowadzać badania przesiewowe mężczyzn i kobiet w wieku 30-80 lat, u których zdiagnozowano PHPT i ocenionych za pomocą 3-miejscowej DXA (kręgosłupa lędźwiowego, biodra i dystalnej kości promieniowej – zarówno 1/3, jak i ultra-dystalnej) oraz markerów obrotu kostnego. Zostaną włączone dwie grupy po 45 pacjentów: 1) Pacjenci z prawidłowym BMD lub łagodną osteopenią (wynik T dla dalszego promienia > -1,5), bez złamań powodujących łamliwość i z poziomem CTX związanym z prawidłowym obrotem kostnym (100-250 pg/ml) ) (nie rozluźnia kości). 2) Osoby z osteoporozą (wskaźnik T-score dla dystalnej części kości promieniowej < -2,5) z jednym lub kilkoma złamaniami powodującymi łamliwość lub bez) i poziomami CTX związanymi z aktywną chorobą (>500 pg/ml) (luźniejsze kości). Próbki krwi i kału zostaną pobrane przez każdego uczestnika. Próbki kału będą natychmiast przechowywane w lodówce z opakowaniami do zamrażania w temperaturze -20°C i przechowywane w temperaturze -80°C do czasu wysłania do COSMOSID w celu sekwencjonowania Metagenomic Shotgun i analizy struktury społeczności mikrobiomu.

Sekwencjonowanie i analiza Metagenomics Shotgun. Różnorodność mikrobiomu i skład każdej próbki kału zostaną określone przez CosmosID Inc., Rockville, MD. W skrócie, DNA z próbek ludzkiego kału zostanie wyizolowane przy użyciu zestawu QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. Biblioteki DNA zostaną przygotowane przy użyciu zestawu do przygotowywania bibliotek Illumina Nextera XT i ilości Biblioteki ocenionej za pomocą Qubit (ThermoFisher). Biblioteki zostaną następnie zsekwencjonowane na platformie Illumina HiSeq 2x150bp. Analiza bioinformatyczna odczytów sekwencjonowania zostanie przeprowadzona przez platformę bioinformatyczną CosmosID, która wykorzystuje wysokowydajne algorytmy eksploracji danych i wysoce dopracowaną dynamiczną bazę danych porównawczych GenBook®.

Punkty końcowe i interpretacja: Ustalimy, czy u pacjentów z PHPT z utratą masy kostnej występuje większa częstość występowania jednej lub więcej bakterii równoważnych SFB indukujących komórki Th17 w porównaniu z pacjentami z grupy kontrolnej z PHPT. Analiza ta dostarczy zatem dowodów dotyczących gatunków i szczepów, które mogą nasilać utratę masy kostnej w PHPT. Punktami końcowymi DXA będą BMD, T-score i Z-score dystalnej i 1/3 kości promieniowej, odcinka lędźwiowego kręgosłupa i biodra.

Obliczenia mocy: Nasza analiza wstępnego zestawu danych wykazała, że ​​BL występowało obficie przy średniej względnej liczebności ~ 5,8% (SD 0,055). Na podstawie tych danych obliczyliśmy, że wpisanie 45 osób na grupę zapewni 80% statystyczną moc wykrywania różnicy dla BL, jeśli średnia względna obfitość BL jest > 1,5-krotnie (8,7%) wyższa u pacjentów z PHPT z niską gęstością kości w porównaniu z grupą kontrolną pacjenci z PPT.

WP2. Oceń, jak skład GM moduluje układ odpornościowy u ludzi (miesiąc 3-10). W celu oceny podzbiorów Th komórki T będą analizowane za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym, mierząc ekspresję genów FOXP3, IL-17A, TNF-alfa i IL-4. Pokrótce, krwinki czerwone zostaną poddane lizie w próbkach krwi obwodowej, a wszystkie komórki jądrzaste zostaną zebrane i zamrożone w temperaturze -80°C do czasu ekstrakcji RNA. RNA będzie izolowane przy użyciu odczynnika TRIzol, ekstrakcji chloroformem, a następnie wytrącania izopropanolem zgodnie ze standardową procedurą. Względna ekspresja cytokin zostanie określona metodą 2-ΔΔCT z normalizacją do β-aktyny. W celu oceny stanu zapalnego zmierzymy IL-17A (główny gatunek IL-17 wytwarzany przez komórki Th17), wolny RANKL, OPG, TNF techniką ELISA. Aby ocenić obrót kostny P1NP (marker tworzenia kości), CTX (marker resorpcji kości), 25OHwitamina D (25OHD) zostaną zmierzone techniką ELISA.

Punkty końcowe i interpretacja. Dane ujawnią istnienie korelacji między szybkością resorpcji kości, podzbiorem komórek Th i poziomami IL-17 i innych cytokin w surowicy. Czy powinniśmy stwierdzić, że skład GM odzwierciedla aktywność choroby; dane posłużą jako podstawa do przyszłych badań interwencyjnych w celu określenia skuteczności antybiotyków lub innych interwencji, takich jak na przykład probiotyki, w łagodzeniu powikłań szkieletowych PHPT. Oczekujemy również, że pacjenci z PHPT z chorobą szkieletu będą mieli niższe poziomy 25OHD niż osoby bez choroby szkieletu. Czy powinniśmy znaleźć korelację między poziomami 25OHD a gatunkami i szczepami bakterii, która sprzyja tworzeniu się komórek Th17? dane dostarczą nowych mechanistycznych informacji o tym, jak poziomy 25OHD wpływają na skłonność do chorób kości w PHPT. W takim przypadku bardzo atrakcyjnym tematem przyszłych badań interwencyjnych będzie propozycja, że ​​zastąpienie witaminy D przywróci skład mikrobiomu, który nie jest związany z chorobami układu kostnego.

Analizy ryzyka i plan awaryjny. Niedobór estrogenu powoduje ekspansję komórek Th17, a wytwarzanie przez nie IL-17 może przyczyniać się do postmenopauzalnej utraty masy kostnej u ludzi. Efekt ten może stanowić ważny czynnik zakłócający, który może ograniczać ocenę roli IL-17 w utracie masy kostnej wywołanej przez PHPT u kobiet we wczesnym okresie pomenopauzalnym. W razie potrzeby poradzimy sobie z tym ograniczeniem, dostosowując statystycznie wpływ płci, wieku i menopauzy.

WP3. Oceń związek przyczynowy między składem GM a aktywacją limfocytów T (miesiąc 6-10). Aby ocenić, czy limfocyty Th są bezpośrednio stymulowane przez białka równoważnych bakterii SFB, przetestujemy jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) bezpośrednio w kierunku BL ATCC 15707 i ocenimy typ odpowiadających limfocytów T techniką ELISPOT. Pokrótce, PBMC od 10 pacjentów ze zwiększoną liczbą komórek Th17 we krwi obwodowej będą testowane przeciwko BL ATCC 15707, a wytwarzanie IL-17, TNF alfa i RANKL będzie badane za pomocą analiz ELISPOT. Te cytokiny w PBMC są wytwarzane specyficznie przez limfocyty T po ich aktywacji. Technika ELISPOT umożliwia badanie wielu białek w jednym eksperymencie. TNF alfa i RANKL inne niż IL-17 zostały wybrane jako kandydujące cytokiny, ponieważ zgłaszający i inni wykazali wcześniej podwyższony poziom tych cytokin w komórkach T u pacjentów dotkniętych osteoporozą pomenopauzalną. Jeśli stwierdzimy bezpośrednią aktywację limfocytów T do BL ATCC 15707, typ limfocytów T odpowiedzialny za aktywację zostanie dodatkowo scharakteryzowany dzięki zastosowaniu techniki sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) z systemem Fluidigm C1 jako pozwala na bardziej dogłębne sekwencjonowanie na komórkę (około 200 000 odczytów). W skrócie, komórki PBMC od 5 pacjentów z odpowiedzią zostaną poddane prowokacji ATCC 15707 lub kontrolnym drobnoustrojem (B. fragilis) przez 6 godzin. Po inkubacji limfocyty T zostaną rozdzielone na podstawie całkowitej liczby komórek jądrzastych krwi za pomocą negatywnego systemu izolacji komórek immunomagnetycznych i ocenione za pomocą scRNA-seq. Zastosowanie scRNA-seq umożliwi nam scharakteryzowanie aktywowanych limfocytów T i ich ekspresji genów. Punkty końcowe i interpretacja. Ustalimy, czy ATC C 15707 jest w stanie bezpośrednio aktywować limfocyty T, a następnie scharakteryzujemy typ odpowiadających limfocytów T. Pozwoli nam to potwierdzić dane asocjacyjne uzyskane w pierwszej części badania i zapewnić mechanistyczny wgląd w związek między GM, aktywacją immunologiczną i utratą masy kostnej.

Analizy ryzyka i plan awaryjny. Jeśli limfocyty T od pacjentów ze zwiększoną liczbą Th17 we krwi obwodowej nie odpowiedzą pozytywnie na prowokację immunologiczną z ATCC 15707, przetestujemy reaktywność limfocytów T w stosunku do innych drobnoustrojów o zwiększonej zawartości w GM osób z utratą kości z PHPT. Szczep GM zdolny do stymulacji komórek Th17 zostanie wybrany zgodnie z wynikami uzyskanymi w WP1. W celu zdefiniowania pozytywnej aktywacji limfocytów T ustaliliśmy próg 70% pozytywnych wyników na prowokację immunologiczną zgodnie z naszymi wstępnymi danymi i poprzednimi wynikami opublikowanymi przez PI.