Primær hyperparathyroidisme og tarmmikrobiota (HYPOGEUM)

Metoder. Projektet vil blive organiseret i tre arbejdspakker (WP). WP1. Bestem, om tilbøjeligheden hos patienter med PHPT til at udvikle knogletab kan forudsiges af sammensætningen af ​​afføringsmikrobiom (måned 0-11). Vi vil screene mænd og kvinder i alderen 30-80 år diagnosticeret med PHPT og evalueret af 3-steds DXA (lændehvirvelsøjlen, hofte og distal radius - både 1/3 og ultra-distale) og knogleomsætningsmarkører. To grupper med hver 45 patienter vil blive inkluderet: 1) Forsøgspersoner med normal BMD eller mild osteopeni (distal radius T-score > -1,5), ingen fragilitetsfrakturer og CTX-niveauer, der er forbundet med normal knogleomsætning (100-250 pg/ml) ) (ikke knogleløsere). 2) Personer med osteoporose (distal radius T-score < -2,5) med eller uden en eller flere skrøbelighedsfrakturer) og CTX-niveauer, der er forbundet med aktiv sygdom (>500 pg/ml) (knogleløsere). Blodprøver og en fæcesprøve vil blive indsamlet af hver deltager. Afføringsprøver opbevares øjeblikkeligt i en køler med -20°C fryserpakker og opbevares ved -80°C, indtil de sendes til COSMOSID til Metagenomic Shotgun-sekventering og analyse af mikrobiomsamfundets struktur.

Metagenomics Shotgun sekventering og analyse. Mikrobiomets mangfoldighed og sammensætning af hver afføringsprøve vil blive bestemt af CosmosID Inc., Rockville, MD. Kort fortalt vil DNA fra humane fæcesprøver blive isoleret ved hjælp af QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit. DNA-biblioteker vil blive forberedt ved hjælp af Illumina Nextera XT biblioteksforberedelseskit og biblioteksmængde vurderet med Qubit (ThermoFisher). Biblioteker vil derefter blive sekventeret på en Illumina HiSeq-platform 2x150bp. Bioinformatisk analyse af sekventeringslæsninger vil blive udført af CosmosID bioinformatikplatform, der bruger højtydende data mining-algoritmer og den højt kurerede dynamiske komparatordatabase GenBook®.

Slutpunkter og fortolkning: Vi vil afgøre, om PHPT-patienter, der mister knogle, har en højere frekvens af en eller flere Th17-celle-inducerende-SFB-ækvivalente bakterier sammenlignet med kontrol-PHT-patienter. Denne analyse vil derfor give beviser vedrørende arter og stammer, der kan forværre knogletab i PHPT. DXA-endepunkterne vil være BMD, T-score og Z-score for den distale og 1/3 radius, lændehvirvelsøjlen og hoften.

Effektberegning: Vores analyse af det foreløbige datasæt afslørede, at BL var rigeligt ved en gennemsnitlig relativ overflod på ~5,8% (SD 0,055). Ud fra disse data beregnede vi, at indskrivning af 45 pr. gruppe vil give 80 % statistisk evne til at påvise en forskel for BL, hvis den gennemsnitlige relative abundance af BL er > 1,5 gange (8,7 %) højere hos PHPT-patienter med lav knogletæthed sammenlignet med kontrol PHPT patienter.

WP2. Evaluer, hvordan GM-sammensætning modulerer immunsystemet hos mennesker (måned 3-10). For at evaluere Th-undersæt, vil T-celler blive analyseret ved real-time RT-PCR, der måler FOXP3, IL-17A, TNF-alfa og IL-4 genekspression. Kort fortalt vil røde blodlegemer blive lyseret i perifere blodprøver, og totale kerneholdige celler opsamles og fryses ved -80°C indtil RNA-ekstraktion. RNA vil blive isoleret ved hjælp af TRIzol-reagens, chloroform-ekstraktion og efterfølgende isopropanol-præcipitation i henhold til standardproceduren. Relativ cytokinekspression vil blive bestemt ved hjælp af 2-ΔΔCT-metoden med normalisering til β-Actin. For at evaluere inflammation vil vi måle IL-17A (hovedarten af ​​IL-17 produceret af Th17-celler), fri RANKL, OPG, TNF ved ELISA-teknik. For at vurdere knogleomsætningen vil P1NP (en markør for knogledannelse), CTX (en markør for knogleresorption), 25OHvitamin D (25OHD) blive målt ved ELISA-teknik.

Slutpunkter og fortolkning. Dataene vil afsløre eksistensen af ​​korrelationer mellem hastigheden af ​​knogleresorption, Th-celleundergruppe og serumniveauer af IL-17 og andre cytokiner. Skulle vi finde ud af, at sammensætningen af ​​GM afspejler sygdommens aktivitet; dataene vil tjene som grundlag for fremtidige interventionsstudier for at bestemme effektiviteten af ​​antibiotika eller andre interventioner som f.eks. probiotika til at lindre skeletkomplikationer af PHPT. Vi forventer også, at PHPT-patienter med skeletsygdom vil have lavere 25OHD-niveauer end dem uden skeletsygdom. Skal vi finde en sammenhæng mellem 25OHD-niveauer og bakteriearter og stammer, der favoriserer Th17-celledannelse; dataene vil give ny mekanistisk information om, hvordan 25OHD-niveauer påvirker tilbøjeligheden til knoglesygdom i PHPT. Skulle dette være tilfældet, vil et meget attraktivt emne for en fremtidig interventionsundersøgelse være påstanden om, at D-vitaminerstatning vil genoprette en mikrobiotasammensætning, der ikke er forbundet med skeletsygdom.

Risikoanalyser og beredskabsplan. Østrogenmangel udvider Th17-celler, og deres produktion af IL-17 kan bidrage til postmenopausalt knogletab hos mennesker. Denne effekt kan repræsentere en vigtig konfounder, som kan begrænse vurderingen af ​​IL-17's rolle i knogletab induceret af PHPT hos tidlige postmenopausale kvinder. Om nødvendigt vil vi håndtere denne begrænsning ved statistisk at justere for virkningerne af køn, alder og overgangsalder.

WP3. Evaluer årsagssammenhængen mellem GM-sammensætning og T-celleaktivering (måned 6-10). For at vurdere, om Th-celler stimuleres direkte af proteiner fra SFB-ækvivalente bakterier, vil vi teste de perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) direkte mod BL ATCC 15707 og evaluere typen af ​​reagerende T-celler ved hjælp af ELISPOT-teknik. Kort fortalt vil PBMC'er fra 10 patienter med øgede Th17-celler i perifert blod blive testet mod BL ATCC 15707, og produktionen af ​​IL-17, TNF alpha og RANKL vil blive testet ved ELISPOT-analyser for. Disse cytokiner i PBMC'erne produceres specifikt af T-celler efter deres aktivering. ELISPOT teknik gør det muligt at teste flere proteiner i et enkelt eksperiment. TNF alfa og RANKL andre end IL-17 er blevet udvalgt som kandidat-cytokiner, da ansøgeren og andre tidligere har vist et øget niveau af disse cytokiner i T-celler fra patienter, der er ramt af postmenopausal osteoporose. Skulle vi finde en direkte aktivering af T-celler til BL ATCC 15707, vil typen af ​​T-celle, der er ansvarlig for aktivering, blive yderligere karakteriseret takket være brugen af ​​enkeltcellet RNA-sekventeringsteknik (scRNA-seq) med Fluidigm C1-systemet som det muliggør en mere dybdegående sekvensering pr. celle (ca. 200.000 aflæsninger). Kort fortalt vil PBMC-celler fra 5 responderende patienter blive udfordret med ATCC 15707 eller med en kontrolmikrobe (B. fragilis) i 6 timer. Efter inkubation vil T-celler blive adskilt af totale blodkerneholdige celler ved hjælp af et negativt immunomagnetisk celleisoleringssystem og evalueret med scRNA-seq. Brugen af ​​scRNA-seq vil gøre os i stand til at karakterisere aktiverede T-celler og deres genekspression Slutpunkter og fortolkning. Vi vil afgøre, om ATC C 15707 er i stand til direkte at aktivere T-celler, og yderligere vil vi karakterisere typen af ​​reagerende T-celle. Dette vil give os mulighed for at bekræfte associationsdataene opnået i den første del af undersøgelsen og give et mekanistisk indblik i forholdet mellem GM, immunaktivering og knogletab.

Risikoanalyser og beredskabsplan. Hvis T-celler fra patienter med øget antal Th17 i det perifere blod ikke vil svare positivt på immunbelastning med ATCC 15707, vil vi teste T-cellers reaktivitet over for andre mikrober øget i GM af PHPT-knogletabere. GM-stamme, der er i stand til at stimulere Th17-celler, vil blive valgt i henhold til resultaterne opnået i WP1. For at definere en positiv T-celleaktivering satte vi en tærskel på 70% af positive resultater til immunudfordring i henhold til vores foreløbige data og med tidligere resultater offentliggjort af PI.