Hiperparatireoidismo Primário e Microbiota Intestinal (HYPOGEUM)

Métodos. O projeto será organizado em três pacotes de trabalho (WP). WP1. Determinar se a propensão dos pacientes com HPTP a desenvolver perda óssea pode ser prevista pela composição do microbioma fecal (mês 0-11). Faremos a triagem de homens e mulheres de 30 a 80 anos com diagnóstico de HPTP e avaliados por DXA de 3 locais (coluna lombar, quadril e rádio distal - 1/3 e ultra-distal) e marcadores de remodelação óssea. Serão inscritos dois grupos com 45 pacientes cada: 1) Indivíduos com DMO normal ou osteopenia leve (escore T do raio distal > -1,5), sem fraturas por fragilidade e níveis de CTX associados a remodelação óssea normal (100-250 pg/ml ) (não osso solto). 2) Indivíduos com osteoporose (escore T do raio distal < -2,5) com ou sem uma ou mais fraturas por fragilidade) e níveis de CTX associados à doença ativa (>500 pg/ml) (osso mais solto). Amostras de sangue e uma amostra fecal serão coletadas por cada participante. As amostras de fezes serão armazenadas imediatamente em um refrigerador com pacotes de freezer a -20°C e armazenadas a -80°C até serem enviadas ao COSMOSID para sequenciamento Metagenómico Shotgun e análise da estrutura da comunidade do microbioma.

Metagenômica Sequenciamento e análise Shotgun. A diversidade e composição do microbioma de cada amostra de fezes serão determinadas pela CosmosID Inc., Rockville, MD. Resumidamente, o DNA de amostras fecais humanas será isolado usando o kit QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. As bibliotecas de DNA serão preparadas usando o kit de preparação de bibliotecas Illumina Nextera XT e a quantidade de bibliotecas avaliada com Qubit (ThermoFisher). As bibliotecas serão sequenciadas em uma plataforma Illumina HiSeq 2x150bp. A análise bioinformática das leituras de sequenciamento será feita pela plataforma de bioinformática CosmosID, que usa algoritmos de mineração de dados de alto desempenho e o banco de dados comparador dinâmico altamente curado GenBook®.

Pontos finais e interpretação: determinaremos se os pacientes com HPPT que perdem osso têm uma frequência maior de uma ou mais bactérias equivalentes a SFB indutoras de células Th17 em comparação com os pacientes de controle com PHPT. Esta análise, portanto, produzirá evidências pertencentes a espécies e cepas que podem exacerbar a perda óssea em PHPT. Os pontos finais do DXA serão DMO, escores T e escores Z do rádio distal e 1/3, coluna lombar e quadril.

Cálculo de Poder: Nossa análise do conjunto de dados preliminares revelou que BL era abundante em abundância relativa média de ~5,8% (SD 0,055). A partir desses dados, calculamos que inscrever 45 por grupo fornecerá 80% de poder estatístico para detectar uma diferença para BL se a abundância relativa média de BL for > 1,5 vezes (8,7%) maior em pacientes PHPPT com baixa densidade óssea em comparação com o controle Pacientes com PHPT.

WP2. Avalie como a composição GM modula o sistema imunológico em humanos (mês 3-10). A fim de avaliar subconjuntos Th, as células T serão analisadas por RT-PCR em tempo real medindo a expressão gênica de FOXP3, IL-17A, TNF-alfa e IL-4. Resumidamente, hemácias serão lisadas em amostras de sangue periférico e células nucleadas totais coletadas e congeladas a -80°C até a extração do RNA. O RNA será isolado usando o reagente TRIzol, extração com clorofórmio e posterior precipitação com isopropanol de acordo com o procedimento padrão. A expressão relativa de citocinas será determinada pelo método 2-ΔΔCT com normalização para β-Actina. Para avaliar a inflamação iremos medir IL-17A (principal espécie de IL-17 produzida pelas células Th17), RANKL livre, OPG, TNF pela técnica de ELISA. Para avaliar a remodelação óssea P1NP (um marcador de formação óssea), CTX (um marcador de reabsorção óssea), 25OHvitamina D (25OHD) serão medidos pela técnica de ELISA.

Pontos finais e interpretação. Os dados revelarão a existência de correlações entre a taxa de reabsorção óssea, o subconjunto de células Th e os níveis séricos de IL-17 e outras citocinas. Devemos descobrir que a composição do GM reflete a atividade da doença; os dados servirão como base para futuros estudos de intervenção para determinar a eficácia de antibióticos ou outras intervenções como, por exemplo, com probióticos na mitigação das complicações esqueléticas do PHPT. Também esperamos que pacientes com HPPT com doença esquelética tenham níveis de 25OHD mais baixos do que aqueles sem doença esquelética. Devemos encontrar uma correlação entre os níveis de 25OHD e espécies e cepas bacterianas que favorecem a formação de células Th17; os dados fornecerão novas informações mecanísticas sobre como os níveis de 25OHD afetam a propensão a doenças ósseas em PHPT. Se for esse o caso, um assunto muito atraente para um futuro estudo de intervenção será a proposição de que a reposição de vitamina D restaurará a composição da microbiota que não está associada a doenças esqueléticas.

Análise de riscos e plano de contingência. A deficiência de estrogênio expande as células Th17 e sua produção de IL-17 pode contribuir para a perda óssea pós-menopausa em humanos. Esse efeito pode representar um fator de confusão importante, o que pode limitar a avaliação do papel da IL-17 na perda óssea induzida pelo HPTP em mulheres na pós-menopausa precoce. Se necessário, administraremos essa limitação ajustando estatisticamente os efeitos de sexo, idade e menopausa.

WP3. Avalie a relação causal entre a composição do GM e a ativação das células T (6-10 meses). A fim de avaliar se as células Th são diretamente estimuladas por proteínas de bactérias equivalentes ao SFB, testaremos as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) diretamente para BL ATCC 15707 e avaliaremos o tipo de células T responsivas pela técnica ELISPOT. Resumidamente, PBMCs de 10 pacientes com células Th17 aumentadas no sangue periférico serão testadas contra BL ATCC 15707 e a produção de IL-17, TNF alfa e RANKL será testada por análises ELISPOT para. Essas citocinas, dentro das PBMCs, são produzidas especificamente pelas células T após sua ativação. A técnica ELISPOT permite testar várias proteínas em um único experimento. TNF alfa e RANKL diferentes de IL-17 foram selecionados como citocinas candidatas como requerente e outros mostraram anteriormente um nível aumentado dessas citocinas em células T de pacientes afetados por osteoporose pós-menopáusica. Se encontrarmos uma ativação direta de células T para BL ATCC 15707, o tipo de célula T responsável pela ativação será posteriormente caracterizado graças ao uso da técnica de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) com o sistema Fluidigm C1 como permite um sequenciamento mais aprofundado por célula (cerca de 200.000 leituras). Resumidamente, as células PBMC de 5 pacientes respondedores serão desafiadas com ATCC 15707 ou com um micróbio de controle (B. fragilis) por 6 horas. Após a incubação, as células T serão separadas por células nucleadas de sangue total por sistema de isolamento de células imunomagnéticas negativas e avaliadas com scRNA-seq. O uso de scRNA-seq nos permitirá caracterizar células T ativadas e seus pontos finais de expressão gênica e interpretação. Determinaremos se o ATC C 15707 é capaz de ativar diretamente as células T e ainda caracterizaremos o tipo de célula T responsiva. Isso nos permitirá confirmar os dados de associação obtidos na primeira parte do estudo e fornecer uma visão mecanicista da relação entre GM, ativação imune e perda óssea.

Análise de riscos e plano de contingência. Se as células T de pacientes com número aumentado de Th17 no sangue periférico não responderem positivamente ao desafio imunológico com ATCC 15707, testaremos a reatividade das células T a outros micróbios aumentados no GM de perdedores ósseos de PHPT. A linhagem GM capaz de estimular células Th17 será escolhida de acordo com os resultados obtidos no WP1. Para definir uma ativação positiva de células T, estabelecemos um limite de 70% de resultados positivos ao desafio imunológico de acordo com nossos dados preliminares e com resultados anteriores publicados pelo PI.