Hiperparatiroidismo primario y microbiota intestinal (HYPOGEUM)

Métodos. El proyecto se organizará en tres paquetes de trabajo (WP). WP1. Determinar si la propensión de los pacientes con HPTP a desarrollar pérdida ósea puede predecirse por la composición del microbioma de las heces (meses 0-11). Evaluaremos a hombres y mujeres de 30 a 80 años de edad diagnosticados con PHPT y evaluados por DXA de 3 sitios (columna lumbar, cadera y radio distal, tanto 1/3 como ultradistal) y marcadores de recambio óseo. Se inscribirán dos grupos con 45 pacientes cada uno: 1) Sujetos con DMO normal u osteopenia leve (puntuación T del radio distal > -1,5), sin fracturas por fragilidad y niveles de CTX asociados con recambio óseo normal (100-250 pg/ml ) (no hueso más suelto). 2) Sujetos con osteoporosis (puntuación T del radio distal < -2,5) con o sin una o más fracturas por fragilidad) y niveles de CTX asociados con enfermedad activa (>500 pg/ml) (hueso más flojo). Cada participante recogerá muestras de sangre y una muestra de heces. Las muestras de heces se almacenarán inmediatamente en un refrigerador con paquetes de congelación a -20 °C y se almacenarán a -80 °C hasta que se envíen a COSMOSID para la secuenciación de escopeta metagenómica y el análisis de la estructura de la comunidad de microbiomas.

Metagenómica Secuenciación y análisis de escopeta. CosmosID Inc., Rockville, MD, determinará la diversidad y composición del microbioma de cada muestra de heces. En resumen, el ADN de las muestras fecales humanas se aislará con el kit QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro. Las bibliotecas de ADN se prepararán con el kit de preparación de bibliotecas Illumina Nextera XT y la cantidad de bibliotecas se evaluará con Qubit (ThermoFisher). Luego, las bibliotecas se secuenciarán en una plataforma Illumina HiSeq 2x150bp. El análisis bioinformático de las lecturas de secuenciación se realizará mediante la plataforma de bioinformática CosmosID que utiliza algoritmos de minería de datos de alto rendimiento y la base de datos de comparación dinámica altamente seleccionada GenBook®.

Puntos finales e interpretación: Determinaremos si los pacientes con PHPT que pierden hueso tienen una frecuencia más alta de una o más bacterias equivalentes a SFB inductoras de células Th17 en comparación con los pacientes de control con PHPT. Por lo tanto, este análisis arrojará evidencia relacionada con las especies y las cepas que pueden exacerbar la pérdida ósea en el PHPT. Los criterios de valoración de la DXA serán la DMO, las puntuaciones T y las puntuaciones Z de la parte distal y 1/3 del radio, la columna lumbar y la cadera.

Cálculo de potencia: nuestro análisis del conjunto de datos preliminares reveló que BL era abundante con una abundancia relativa media de ~5,8 % (DE 0,055). A partir de estos datos, calculamos que inscribir a 45 por grupo proporcionará un poder estadístico del 80 % para detectar una diferencia de BL si la abundancia relativa media de BL es > 1,5 veces (8,7 %) mayor en pacientes con HPTP con baja densidad ósea en comparación con el control Pacientes con PHPT.

WP2. Evaluar cómo la composición de GM modula el sistema inmunológico en humanos (meses 3-10). Para evaluar los subconjuntos Th, las células T se analizarán mediante RT-PCR en tiempo real que mide la expresión génica de FOXP3, IL-17A, TNF-alfa e IL-4. Brevemente, los glóbulos rojos se lisarán en muestras de sangre periférica y las células nucleadas totales se recolectarán y congelarán a -80°C hasta la extracción del ARN. El ARN se aislará utilizando el reactivo TRIzol, la extracción con cloroformo y la posterior precipitación con isopropanol de acuerdo con el procedimiento estándar. La expresión relativa de citocinas se determinará utilizando el método 2-ΔΔCT con normalización a β-actina. Para evaluar la inflamación mediremos IL-17A (principal especie de IL-17 producida por las células Th17), RANKL libre, OPG, TNF por técnica ELISA. Para evaluar el recambio óseo, P1NP (un marcador de formación ósea), CTX (un marcador de resorción ósea), 25OHvitamina D (25OHD) se medirán mediante la técnica ELISA.

Puntos finales e interpretación. Los datos revelarán la existencia de correlaciones entre la tasa de reabsorción ósea, el subconjunto de células Th y los niveles séricos de IL-17 y otras citocinas. ¿Deberíamos encontrar que la composición del GM refleja la actividad de la enfermedad; los datos servirán como base para futuros estudios de intervención para determinar la eficacia de los antibióticos u otras intervenciones como, por ejemplo, con probióticos para mitigar las complicaciones esqueléticas del PHPT. También esperamos que los pacientes con PHPT con enfermedad esquelética tengan niveles más bajos de 25OHD que aquellos sin enfermedad esquelética. ¿Deberíamos encontrar una correlación entre los niveles de 25OHD y las especies y cepas bacterianas que favorezca la formación de células Th17; los datos proporcionarán nueva información mecánica sobre cómo los niveles de 25OHD afectan la propensión a la enfermedad ósea en PHPT. Si este fuera el caso, un tema muy atractivo para un futuro estudio de intervención será la proposición de que el reemplazo de vitamina D restaurará una composición de microbiota que no está asociada con enfermedades esqueléticas.

Análisis de riesgos y plan de contingencia. La deficiencia de estrógeno expande las células Th17 y su producción de IL-17 puede contribuir a la pérdida ósea posmenopáusica en humanos. Este efecto podría representar un factor de confusión importante, que podría limitar la evaluación del papel de la IL-17 en la pérdida ósea inducida por HPTP en mujeres posmenopáusicas tempranas. Si es necesario, gestionaremos esta limitación ajustando estadísticamente los efectos del sexo, la edad y la menopausia.

WP3. Evaluar la relación causal entre la composición de GM y la activación de las células T (meses 6-10). Para evaluar si las células Th son estimuladas directamente por proteínas de bacterias equivalentes a SFB, probaremos las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) directamente hacia BL ATCC 15707 y evaluaremos el tipo de células T que responden mediante la técnica ELISPOT. Brevemente, las PBMC de 10 pacientes con aumento de células Th17 en sangre periférica se analizarán frente a BL ATCC 15707 y la producción de IL-17, TNF alfa y RANKL se analizará mediante análisis ELISPOT. Estas citoquinas, dentro de las PBMC, son producidas específicamente por las células T luego de su activación. La técnica ELISPOT permite probar múltiples proteínas en un solo experimento. TNF alfa y RANKL distintos de IL-17 se han seleccionado como citoquinas candidatas según el solicitante y otros han mostrado previamente un nivel aumentado de estas citoquinas en células T de pacientes afectados por osteoporosis posmenopáusica. Si encontramos una activación directa de las células T a BL ATCC 15707, el tipo de célula T es responsable de la activación se caracterizará aún más gracias al uso de la técnica de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) con el sistema Fluidigm C1 como permite una secuenciación más profunda por celda (alrededor de 200.000 lecturas). Brevemente, las células PBMC de 5 pacientes que respondieron se desafiarán con ATCC 15707 o con un microbio de control (B. fragilis) durante 6 horas. Después de la incubación, las células T se separarán del total de células nucleadas en sangre mediante un sistema de aislamiento de células inmunomagnético negativo y se evaluarán con scRNA-seq. El uso de scRNA-seq nos permitirá caracterizar las células T activadas y sus puntos finales de expresión génica e interpretación. Determinaremos si ATC C 15707 puede activar directamente las células T y, además, caracterizaremos el tipo de célula T que responde. Esto nos permitirá confirmar los datos de asociación obtenidos en la primera parte del estudio y brindar una visión mecánica de la relación entre GM, activación inmunológica y pérdida ósea.

Análisis de riesgos y plan de contingencia. Si las células T de pacientes con un mayor número de Th17 en la sangre periférica no responden positivamente al desafío inmunitario con ATCC 15707, probaremos la reactividad de las células T hacia otros microbios aumentados en el GM de los perdedores óseos PHPT. La cepa GM capaz de estimular las células Th17 se elegirá de acuerdo con los resultados obtenidos en WP1. Para definir una activación positiva de las células T, establecimos un umbral del 70 % de resultados positivos para el desafío inmunitario de acuerdo con nuestros datos preliminares y con los resultados previos publicados por el PI.