Primär hyperparatyreos och tarmmikrobiota (HYPOGEUM)

Metoder. Projektet kommer att organiseras i tre arbetspaket (WP). WP1. Bestäm om benägenheten hos patienter med PHPT att utveckla benförlust kan förutsägas av sammansättningen av avföringsmikrobiomet (månad 0-11). Vi kommer att screena män och kvinnor i åldern 30-80 år som diagnostiserats med PHPT och utvärderas av 3-plats DXA (ländrygg, höft och distal radie- både 1/3 och ultra-distal), och benomsättningsmarkörer. Två grupper med 45 patienter vardera kommer att inkluderas: 1) Försökspersoner med normal BMD eller mild osteopeni (distal radie T-poäng > -1,5), inga skörhetsfrakturer och CTX-nivåer som är associerade med normal benomsättning (100-250 pg/ml) ) (inte benlösare). 2) Patienter med osteoporos (distal radius T-score < -2,5) med eller utan en eller flera fragilitetsfrakturer) och CTX-nivåer som är associerade med aktiv sjukdom (>500 pg/ml) (ben lösare). Blodprover och ett avföringsprov kommer att samlas in av varje deltagare. Avföringsprover kommer att förvaras omedelbart i en kylare med -20°C frysförpackningar och förvaras vid -80°C tills de skickas till COSMOSID för Metagenomic Shotgun-sekvensering och analys av mikrobiomsamhällets struktur.

Metagenomics Shotgun sekvensering och analys. Mikrobiomets mångfald och sammansättning av varje avföringsprov kommer att bestämmas av CosmosID Inc., Rockville, MD. Kortfattat kommer DNA från mänskliga fekala prover att isoleras med QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit. DNA-bibliotek kommer att förberedas med hjälp av Illumina Nextera XT biblioteksförberedelsesats och bibliotekskvantitet bedömd med Qubit (ThermoFisher). Biblioteken kommer sedan att sekvenseras på en Illumina HiSeq-plattform 2x150bp. Bioinformatisk analys av sekvensläsningar kommer att göras av CosmosID bioinformatikplattform som använder högpresterande datautvinningsalgoritmer och den mycket kurerade dynamiska komparatordatabasen GenBook®.

Slutpunkter och tolkning: Vi kommer att avgöra om PHPT-patienter som tappar ben har en högre frekvens av en eller flera Th17-cell-inducerande-SFB-ekvivalenta bakterier jämfört med kontroll-PHT-patienter. Denna analys kommer därför att ge bevis för arter och stammar som kan förvärra benförlust i PHPT. DXA-ändpunkterna kommer att vara BMD, T-poäng och Z-poäng för distala och 1/3 radie, ländrygg och höft.

Effektberäkning: Vår analys av den preliminära datamängden avslöjade att BL var rikligt vid genomsnittlig relativ förekomst av ~5,8% (SD 0,055). Från dessa data beräknade vi att inskrivning av 45 per grupp kommer att ge 80 % statistisk förmåga att upptäcka en skillnad för BL om den genomsnittliga relativa förekomsten av BL är > 1,5 gånger (8,7 %) högre hos PHPT-patienter med låg bentäthet jämfört med kontroll PHPT-patienter.

WP2. Utvärdera hur GM-sammansättningen modulerar immunsystemet hos människor (månad 3-10). För att utvärdera Th-undergrupper kommer T-celler att analyseras med realtids-RT-PCR som mäter FOXP3, IL-17A, TNF-alfa och IL-4 genuttryck. Kortfattat kommer röda blodkroppar att lyseras i perifera blodprover och totala kärnförsedda celler samlas in och frysas vid -80°C tills RNA-extraktion. RNA kommer att isoleras med TRIzol-reagens, kloroformextraktion och efterföljande isopropanolfällning enligt standardförfarande. Relativt cytokinuttryck kommer att bestämmas med användning av 2-ΔΔCT-metoden med normalisering till β-aktin. För att utvärdera inflammation kommer vi att mäta IL-17A (huvudarten av IL-17 producerad av Th17-celler), fri RANKL, OPG, TNF med ELISA-teknik. För att bedöma benomsättningen P1NP (en markör för benbildning), CTX (en markör för benresorption), 25OHvitamin D (25OHD) kommer att mätas med ELISA-teknik.

Slutpunkter och tolkning. Data kommer att avslöja förekomsten av korrelationer mellan hastigheten för benresorption, Th-cellundergrupp och serumnivåer av IL-17 och andra cytokiner. Skulle vi finna att sammansättningen av GM reflekterar sjukdomens aktivitet; data kommer att fungera som grunden för framtida interventionsstudier för att fastställa effektiviteten av antibiotika eller andra interventioner som till exempel med probiotika för att lindra skelettkomplikationer av PHPT. Vi förväntar oss också att PHPT-patienter med skelettsjukdom kommer att ha lägre 25OHD-nivåer än de utan skelettsjukdom. Ska vi hitta en korrelation mellan 25OHD-nivåer och bakteriearter och stammar som gynnar Th17-cellbildning; data kommer att ge ny mekanistisk information om hur 25OHD-nivåer påverkar benägenheten för bensjukdom i PHPT. Om så skulle vara fallet kommer ett mycket attraktivt ämne för en framtida interventionsstudie att vara förslaget att vitamin D-ersättning kommer att återställa en mikrobiotasammansättning som inte är associerad med skelettsjukdom.

Riskanalyser och beredskapsplan. Östrogenbrist expanderar Th17-celler och deras produktion av IL-17 kan bidra till postmenopausal benförlust hos människor. Denna effekt kan representera en viktig förvirring, vilket kan begränsa bedömningen av IL-17:s roll i benförlusten inducerad av PHPT hos kvinnor i tidiga postmenopausala kvinnor. Vid behov kommer vi att hantera denna begränsning genom att statistiskt justera för effekterna av kön, ålder och klimakteriet.

WP3. Utvärdera orsakssambandet mellan GM-sammansättning och T-cellsaktivering (månad 6-10). För att utvärdera om Th-celler stimuleras direkt av proteiner från SFB-ekvivalenta bakterier kommer vi att testa de perifera mononukleära blodcellerna (PBMC) direkt mot BL ATCC 15707 och utvärdera typen av svarande T-celler med ELISPOT-teknik. Kortfattat kommer PBMC från 10 patienter med ökade Th17-celler i perifert blod att testas mot BL ATCC 15707 och produktionen av IL-17, TNF alfa och RANKL kommer att testas med ELISPOT-analyser för. Dessa cytokiner, inom PBMC, produceras specifikt av T-celler efter deras aktivering. ELISPOT-tekniken gör det möjligt att testa flera proteiner i ett enda experiment. Andra TNF alfa och RANKL än IL-17 har valts ut som kandidatcytokiner eftersom sökanden och andra tidigare har visat en ökad nivå av dessa cytokiner i T-celler från patienter som drabbats av postmenopausal osteoporos. Skulle vi hitta en direkt aktivering av T-celler till BL ATCC 15707, kommer typen av T-cell som är ansvarig för aktiveringen att karakteriseras ytterligare tack vare användningen av encellig RNA-sekvenseringsteknik (scRNA-seq) med Fluidigm C1-systemet som den tillåter en mer djupgående sekvensering per cell (cirka 200 000 avläsningar). Kortfattat kommer PBMC-celler från 5 patienter som svarar att utmanas med ATCC 15707 eller med en kontrollmikrob (B. fragilis) i 6 timmar. Efter inkubation kommer T-celler att separeras av totala blodkärnförsedda celler genom negativt immunomagnetiskt cellisoleringssystem och utvärderas med scRNA-seq. Användningen av scRNA-seq kommer att göra det möjligt för oss att karakterisera aktiverade T-celler och deras genuttryck Slutpunkter och tolkning. Vi kommer att avgöra om ATC C 15707 kan direkt aktivera T-celler och vidare kommer vi att karakterisera typen av svarande T-cell. Detta kommer att tillåta oss att bekräfta associationsdata som erhölls i den första delen av studien och ge en mekanistisk insikt i sambandet mellan GM, immunaktivering och benförlust.

Riskanalyser och beredskapsplan. Om T-celler från patienter med ökat antal Th17 i det perifera blodet inte kommer att svara positivt på immunförsvaret med ATCC 15707, kommer vi att testa T-cellers reaktivitet mot andra mikrober ökade i GM hos benförlorare i PHPT. GM-stam som kan stimulera Th17-celler kommer att väljas enligt resultaten som erhålls i WP1. För att definiera en positiv T-cellsaktivering satte vi ett tröskelvärde på 70% av positiva resultat för immunutmaning enligt våra preliminära data och med tidigare resultat publicerade av PI.