石灰化皮膚症における真皮弾性線維の変化：多光子顕微鏡を使用した構造研究 (Calciphoton)

組織内のミネラル沈着を伴う病状の種類は多岐にわたります (癌、感染症、環境疾患) (1)。 皮膚科学では、カルシフィラキシスや弾性仮性黄色腫（PXE）など、いくつかの病状がカルシウムミネラル沈着に関連しています。 現在まで、皮膚のミネラル沈着物の化学的特徴、その生理病理学的影響、関連する病状の発生、および人体臓器への影響についての研究はほとんど行われていない。

これは、カルシフィラキシー (2) やサルコイドーシス (3) を含むさまざまな石灰化性皮膚疾患におけるカルシウム沈着の特徴付けに関するヘスター コルボック医学博士の博士号プロジェクトの動機となっています。 この基礎研究プロジェクトは、LCP（パリ・サクレー大学CNRS物理化学研究所）とAP-HPとの共同研究の枠組みで、特に尿腎学（尿路結石症）および腫瘍学の分野で実施される。 (4) (乳がんおよび甲状腺がんにおける石灰化)。 我々は、皮膚石灰化がカルシフィラクシスではカルバパタイトからなり、サルコイドーシスではカルサイトから構成されることを示しました。 我々はまた、これらの沈着物が主に真皮または血管壁の弾性線維に位置していることを示し、これらの線維内の分子核形成経路が探索されることを示唆しています。

この構造的および化学的説明は革新的ですが、これらのカルシウム沈着に関して生じるすべての疑問に答えているわけではありません。つまり、リンカルシウムのバランスが正常であるにもかかわらず、一部の患者が皮膚に大量の石灰化を起こしているのはなぜでしょうか? それどころか、一部の透析患者など他の患者は、リン酸石灰酸バランスシートが著しく乱れているのに、皮膚石灰化が見られないのはなぜでしょうか? この矛盾により、皮膚の弾性線維や血管線維内に「核形成巣」が存在し、一部の患者ではリン石灰沈着の沈殿が促進される可能性が生じます。 いくつかの in vitro モデルでは、弾性繊維内のこれらの核形成焦点を調査しました。 (Gourgas et al を参照) 非常に注目すべきことに、ほとんどの石灰化性皮膚症は皮膚の炎症状態が先行します。 これらの皮膚の炎症現象は、カルシウム沈着の沈殿を引き起こす可能性もあります。 したがって、一部の著者は、エラスチンが細胞外マトリックス内のメタロプロテイナーゼ (MMP) によって消化され、その結果、リン酸石灰沈着に有利な核形成焦点が生成されると推測しています。 ムナヴァリら。は、急速な体重減少に伴うカルシフィラキシー患者の尿サンプル中のMMPレベルの増加を示しました(5)。 彼らは、この患者の血清MMPレベルの上昇が外部弾性限界の変化と血管の石灰化を引き起こす可能性があると仮説を立てています。 一方、この仮説は、炎症や石灰化が存在しない皮膚の老化（皮膚粗鬆症）時など、弾性線維変化の他のモデルによっても支持されています。

私たちのプロジェクトの背景仮説は、皮膚の炎症が弾性線維の特定の変化を引き起こし、それが石灰化を助長するというものです。

この仮説を、特にカルシフィラキシーおよび PXE 中に調査するために、我々は、エコール ポリテクニックの光学および生物科学研究所 (LOB) で利用可能なイメージング技術である多光子顕微鏡を使用することを提案します。 多光子顕微鏡は、サブマイクロメートルの解像度で生体組織の詳細なイメージングを向上させるために、共焦点顕微鏡の代替として 1990 年代初頭に開発されました。 最も重要なことは、多光子顕微鏡では、組織のさまざまな要素を識別するために、ラベルを付けずにいくつかのコントラストの塊を並行して組み合わせることができるということです。 第二高調波発生 (SHG) 信号により、比類のない感度で未染色の線維状コラーゲンの特異的なイメージングが可能になります。また、二光子励起蛍光 (2PEF) により、さまざまな固有の細胞発色団による細胞イメージングや、真皮または他の組織のエラスチン イメージングが可能になります (「参照」を参照)。図1)(6)。

多光子顕微鏡法は、LOB などの皮膚に関するいくつかの研究で使用されており (図 1 を参照)、真皮線維、特にエラスチン線維とコラーゲン線維の構造特性評価とそれらの変化の可能性について、この技術の高い関連性が証明されています。 これは、皮膚の老化の研究だけでなく、弾性線維の変性 (PXE) やコラーゲン線維 (マルファン症候群) につながる病状の研究にも応用されています (7-9)。 したがって、この技術は、皮膚の炎症現象や石灰化皮膚炎の際の弾性線維の構造を調査するのに非常に適しています。

並行して、皮膚の炎症過程が他の方法によって調査される予定です。 以前の研究で行われたように、免疫組織化学は皮膚MMPを検出するために使用され、X線蛍光（シンクロトロンソレイル、Diffabsラインで）は皮内の亜鉛および他の金属沈着物を証明するために使用されます（図2）。

図 2: 皮膚生検の蛍光 X 線: 皮膚炎症性浸潤 (A) と皮内亜鉛の存在 (B) の間の相関関係の例。ここではタトゥー上の苔癬様反応中 (画像は Soleil Synchrotron、Diffabs ライン、 S. Reguer、D. Bazin、H. Colboc 著）。

私たちのプロジェクトの主な目的は、石灰化皮膚症における弾性線維の構造変化を特徴付けることです。

二次的な目標は次のとおりです。

• 皮膚の炎症過程が弾性線維の変化に及ぼす影響を研究するため、
• 弾性皮膚線維および血管線維内でのリンカルシウム沈着物の形成の可能性のある核形成焦点を特定する。

皮膚サンプル。 この研究は主にヒトの皮膚で行われますが、PXEのマウスモデルであるABCC6 KOマウスでも行われます。 より正確には、LOB で学習される内容は次のとおりです。

• これらの石灰化皮膚病：PXE、カルシフィラクシス、その他の石灰化炎症性皮膚病（脂肪織織炎、皮膚筋炎）の診断のために、テノン病院の病理検査室からヒトの皮膚生検がすでに収集されています（モグレ博士）。
• 対照として、テノン病院からのさまざまな年齢の患者からの健康な皮膚の人体生検（皮膚腫瘍切除の縁）。 私たちは皮膚の老化が進んだ患者、特に太陽線弾症の患者に焦点を当てます。 ＵＶ誘発性弾性線維変化のこのモデルは、非炎症性および非石灰化弾性線維損傷の点で優れた制御である。
• テノン病院 INSERM Unit 1155 の PXE マウス モデル (ABCC6 KO マウス) および対応する対照マウスからの皮膚生検。

プロトコル。 これらすべての生検は、弾性線維とコラーゲン線維を同時に画像化するために、2PEF と SHG コントラストを組み合わせた多光子顕微鏡によって特徴付けられます。 最初のステップでは、実験プロトコルは次のようになります。

• テノン病院での各生検からの複数の連続スライドの作成: 多光子イメージング用の未染色 (「白い」) スライド 1 枚、通常の形態学的染色 (ヘマトキシリン-エオシン-サフラン、HES) を施したスライド 1 枚、カルシウム沈着物を強調表示する染色を施した 1 枚のスライド (Von Kossa) ) および主要な MMP (MMP-1、2、および 9 に対する抗体) の免疫組織化学的標識を含む 3 枚のスライド。
• 標準的な明視野光学顕微鏡（標準および偏光透過光、蛍光、DIC）上の LOB で、モザイク処理による広い視野にわたるすべての染色スライドの画像化。炎症プロセス、組織リモデリング、またはミネラル沈着に対応する関心領域 (ROI) の特定。 鉱物堆積物は、偏光透過光または位相コントラストまたは DIC によって明らかにされることに注意してください。
• ソレイユ シンクロトロンでの X 線蛍光イメージングにより、生検材料に存在する金属沈着物、特に亜鉛を特定します。 これは、Diffabs ラインの鉱物イメージングに強い専門知識を持つ Dominique Bazin (パリ サクレー大学 CNRS 物理化学研究所) と共同で行われます。
• 特定された関心領域の LOB での多光子イメージング、または複数のタイルを自動的にステッチすることによる広い視野での多光子イメージング。 偏光分解画像は、コラーゲンおよびエラスチン線維の方向をマッピングするために、非常に密集した領域または再構築された領域でも実行されます (10)。
• エラスチンの量と構造に関連するいくつかのパラメーターを測定するための多光子 LOB 画像の自動定量分析。 自動定量分析は、多光子画像または組織学的画像で観察されたコラーゲンおよびその他の対象構造に対しても実行されます。 さまざまな画像モダリティの結果は、各一連のスライド上で相関付けられます。 自動分析は、半定量分析の通常のバイアスを回避し、より有益な構造パラメーターを取得するために不可欠であることに注意してください。 たとえば、次のパラメータがエラスチン画像から抽出されます: 弾性線維の平均密度 (cm2 あたり、真皮乳頭層および真皮網様体)、弾性線維の配向分布、エントロピー、円分散この分布の、弾性繊維の曲率の程度、鉱床からの距離。
• 適切な統計テストに基づく、マルチモーダル データの統計分析。 入手可能なヒトサンプルの数が比較的少ないことを考慮して、アプリオリなノンパラメトリック検定 (Wilcoxon-Mann-Whitney) が使用されます。 1 グループあたり最低 8 人の患者が研究されますが、自動測定の精度と再現性により、これで十分です。 複数のサンプルまたは一連の画像が同じ患者に対して実行される場合、ネストされた統計検定 (ネストされた t 検定またはネストされた Wilcoxon) が使用されます。

第 2 ステップでは、第 1 ステップの結果に基づいて、より多くの情報にアクセスできるようにこのプロトコルのさまざまな項目が改善されます。

• エラスチンの 3D 組織をより強調するために、無傷のマウス皮膚生検で多光子イメージングが実行されます。
• 炎症の高度な蛍光イメージングは​​、スペクトルまたは FLIM (蛍光寿命画像顕微鏡) 測定を使用して、生体外のマウスの皮膚で実行されます。

• 第三高調波発生 (THG) は、鉱床の構造を視覚化するために使用されます。

  1. バジン D、他。 病理学的微小石灰化の特徴付けといくつかの物理化学的側面。 Chem Rev. 10 oct 2012;112(10):5092-120。

組織内のミネラル沈着を伴う病状の種類は多岐にわたります (癌、感染症、環境疾患) (1)。 皮膚科学では、カルシフィラキシスや弾性仮性黄色腫（PXE）など、いくつかの病状がカルシウムミネラル沈着に関連しています。 現在まで、皮膚のミネラル沈着物の化学的特徴、その生理病理学的影響、関連する病状の発生、および人体臓器への影響についての研究はほとんど行われていない。

これは、カルシフィラキシー (2) やサルコイドーシス (3) を含むさまざまな石灰化性皮膚疾患におけるカルシウム沈着の特徴付けに関するヘスター コルボック医学博士の博士号プロジェクトの動機となっています。 この基礎研究プロジェクトは、LCP（パリ・サクレー大学CNRS物理化学研究所）とAP-HPとの共同研究の枠組みで、特に尿腎学（尿路結石症）および腫瘍学の分野で実施される。 (4) (乳がんおよび甲状腺がんにおける石灰化)。 我々は、皮膚石灰化がカルシフィラクシスではカルバパタイトからなり、サルコイドーシスではカルサイトから構成されることを示しました。 我々はまた、これらの沈着物が主に真皮または血管壁の弾性線維に位置していることを示し、これらの線維内の分子核形成経路が探索されることを示唆しています。

この構造的および化学的説明は革新的ですが、これらのカルシウム沈着に関して生じるすべての疑問に答えているわけではありません。つまり、リンカルシウムのバランスが正常であるにもかかわらず、一部の患者が皮膚に大量の石灰化を起こしているのはなぜでしょうか? それどころか、一部の透析患者など他の患者は、リン酸石灰酸バランスシートが著しく乱れているのに、皮膚石灰化が見られないのはなぜでしょうか? この矛盾により、皮膚の弾性線維や血管線維内に「核形成巣」が存在し、一部の患者ではリン石灰沈着の沈殿が促進される可能性が生じます。 いくつかの in vitro モデルでは、弾性繊維内のこれらの核形成焦点を調査しました。 (Gourgas et al を参照) 非常に注目すべきことに、ほとんどの石灰化性皮膚症は皮膚の炎症状態が先行します。 これらの皮膚の炎症現象は、カルシウム沈着の沈殿を引き起こす可能性もあります。 したがって、一部の著者は、エラスチンが細胞外マトリックス内のメタロプロテイナーゼ (MMP) によって消化され、その結果、リン酸石灰沈着に有利な核形成焦点が生成されると推測しています。 ムナヴァリら。は、急速な体重減少に伴うカルシフィラキシー患者の尿サンプル中のMMPレベルの増加を示しました(5)。 彼らは、この患者の血清MMPレベルの上昇が外部弾性限界の変化と血管の石灰化を引き起こす可能性があると仮説を立てています。 一方、この仮説は、炎症や石灰化が存在しない皮膚の老化（皮膚粗鬆症）時など、弾性線維変化の他のモデルによっても支持されています。

私たちのプロジェクトの背景仮説は、皮膚の炎症が弾性線維の特定の変化を引き起こし、それが石灰化を助長するというものです。

この仮説を、特にカルシフィラキシーおよび PXE 中に調査するために、我々は、エコール ポリテクニックの光学および生物科学研究所 (LOB) で利用可能なイメージング技術である多光子顕微鏡を使用することを提案します。 多光子顕微鏡は、サブマイクロメートルの解像度で生体組織の詳細なイメージングを向上させるために、共焦点顕微鏡の代替として 1990 年代初頭に開発されました。 最も重要なことは、多光子顕微鏡では、組織のさまざまな要素を識別するために、ラベルを付けずにいくつかのコントラストの塊を並行して組み合わせることができるということです。 第二高調波発生 (SHG) 信号により、比類のない感度で未染色の線維状コラーゲンの特異的なイメージングが可能になります。また、二光子励起蛍光 (2PEF) により、さまざまな固有の細胞発色団による細胞イメージングや、真皮または他の組織のエラスチン イメージングが可能になります (「参照」を参照)。図1)(6)。

多光子顕微鏡法は、LOB などの皮膚に関するいくつかの研究で使用されており (図 1 を参照)、真皮線維、特にエラスチン線維とコラーゲン線維の構造特性評価とそれらの変化の可能性について、この技術の高い関連性が証明されています。 これは、皮膚の老化の研究だけでなく、弾性線維の変性 (PXE) やコラーゲン線維 (マルファン症候群) につながる病状の研究にも応用されています (7-9)。 したがって、この技術は、皮膚の炎症現象や石灰化皮膚炎の際の弾性線維の構造を調査するのに非常に適しています。

並行して、皮膚の炎症過程が他の方法によって調査される予定です。 以前の研究で行われたように、免疫組織化学は皮膚MMPを検出するために使用され、X線蛍光（シンクロトロンソレイル、Diffabsラインで）は皮内の亜鉛および他の金属沈着物を証明するために使用されます（図2）。

図 2: 皮膚生検の蛍光 X 線: 皮膚炎症性浸潤 (A) と皮内亜鉛の存在 (B) の間の相関関係の例。ここではタトゥー上の苔癬様反応中 (画像は Soleil Synchrotron、Diffabs ライン、 S. Reguer、D. Bazin、H. Colboc 著）。

私たちのプロジェクトの主な目的は、石灰化皮膚症における弾性線維の構造変化を特徴付けることです。

二次的な目標は次のとおりです。

• 皮膚の炎症過程が弾性線維の変化に及ぼす影響を研究するため、
• 弾性皮膚線維および血管線維内でのリンカルシウム沈着物の形成の可能性のある核形成焦点を特定する。

皮膚サンプル。 この研究は主にヒトの皮膚で行われますが、PXEのマウスモデルであるABCC6 KOマウスでも行われます。 より正確には、LOB で学習される内容は次のとおりです。

• これらの石灰化皮膚病：PXE、カルシフィラクシス、その他の石灰化炎症性皮膚病（脂肪織織炎、皮膚筋炎）の診断のために、テノン病院の病理検査室からヒトの皮膚生検がすでに収集されています（モグレ博士）。
• 対照として、テノン病院からのさまざまな年齢の患者からの健康な皮膚の人体生検（皮膚腫瘍切除の縁）。 私たちは皮膚の老化が進んだ患者、特に太陽線弾症の患者に焦点を当てます。 ＵＶ誘発性弾性線維変化のこのモデルは、非炎症性および非石灰化弾性線維損傷の点で優れた制御である。
• テノン病院 INSERM Unit 1155 の PXE マウス モデル (ABCC6 KO マウス) および対応する対照マウスからの皮膚生検。

プロトコル。 これらすべての生検は、弾性線維とコラーゲン線維を同時に画像化するために、2PEF と SHG コントラストを組み合わせた多光子顕微鏡によって特徴付けられます。 最初のステップでは、実験プロトコルは次のようになります。

• テノン病院での各生検からの複数の連続スライドの作成: 多光子イメージング用の未染色 (「白い」) スライド 1 枚、通常の形態学的染色 (ヘマトキシリン-エオシン-サフラン、HES) を施したスライド 1 枚、カルシウム沈着物を強調表示する染色を施した 1 枚のスライド (Von Kossa) ) および主要な MMP (MMP-1、2、および 9 に対する抗体) の免疫組織化学的標識を含む 3 枚のスライド。
• 標準的な明視野光学顕微鏡（標準および偏光透過光、蛍光、DIC）上の LOB で、モザイク処理による広い視野にわたるすべての染色スライドの画像化。炎症プロセス、組織リモデリング、またはミネラル沈着に対応する関心領域 (ROI) の特定。 鉱物堆積物は、偏光透過光または位相コントラストまたは DIC によって明らかにされることに注意してください。
• ソレイユ シンクロトロンでの X 線蛍光イメージングにより、生検材料に存在する金属沈着物、特に亜鉛を特定します。 これは、Diffabs ラインの鉱物イメージングに強い専門知識を持つ Dominique Bazin (パリ サクレー大学 CNRS 物理化学研究所) と共同で行われます。
• 特定された関心領域の LOB での多光子イメージング、または複数のタイルを自動的にステッチすることによる広い視野での多光子イメージング。 偏光分解画像は、コラーゲンおよびエラスチン線維の方向をマッピングするために、非常に密集した領域または再構築された領域でも実行されます (10)。
• エラスチンの量と構造に関連するいくつかのパラメーターを測定するための多光子 LOB 画像の自動定量分析。 自動定量分析は、多光子画像または組織学的画像で観察されたコラーゲンおよびその他の対象構造に対しても実行されます。 さまざまな画像モダリティの結果は、各一連のスライド上で相関付けられます。 自動分析は、半定量分析の通常のバイアスを回避し、より有益な構造パラメーターを取得するために不可欠であることに注意してください。 たとえば、次のパラメータがエラスチン画像から抽出されます: 弾性線維の平均密度 (cm2 あたり、真皮乳頭層および真皮網様体)、弾性線維の配向分布、エントロピー、円分散この分布の、弾性繊維の曲率の程度、鉱床からの距離。
• 適切な統計テストに基づく、マルチモーダル データの統計分析。 入手可能なヒトサンプルの数が比較的少ないことを考慮して、アプリオリなノンパラメトリック検定 (Wilcoxon-Mann-Whitney) が使用されます。 1 グループあたり最低 8 人の患者が研究されますが、自動測定の精度と再現性により、これで十分です。 複数のサンプルまたは一連の画像が同じ患者に対して実行される場合、ネストされた統計検定 (ネストされた t 検定またはネストされた Wilcoxon) が使用されます。

第 2 ステップでは、第 1 ステップの結果に基づいて、より多くの情報にアクセスできるようにこのプロトコルのさまざまな項目が改善されます。

• エラスチンの 3D 組織をより強調するために、無傷のマウス皮膚生検で多光子イメージングが実行されます。
• 炎症の高度な蛍光イメージングは​​、スペクトルまたは FLIM (蛍光寿命画像顕微鏡) 測定を使用して、生体外のマウスの皮膚で実行されます。

• 第三高調波発生 (THG) は、鉱床の構造を視覚化するために使用されます。

  1. バジン D、他。 病理学的微小石灰化の特徴付けといくつかの物理化学的側面。 Chem Rev. 10 oct 2012;112(10):5092-120。
  2. H.コルボックら。 石灰性尿毒症性細動脈症患者におけるカルシフィラキシス関連皮膚沈着物の局在、形態学的特徴、および化学組成。 JAMA皮膚科2019。
  3. H.コルボックら。 皮膚サルコイドーシスにおける肉芽腫に関連する無機沈着物の物理化学的特徴付け。 欧州皮膚科学会および性病学ジャーナル 2018。
  4. ハカ AS 他 ラマン分光法を使用して化学組成の違いを調べることにより、良性および悪性の乳房病変における微小石灰化を特定します。 がん研究所2002 年 9 月 15 日;62(18):5375-80。
  5. Munavalli G, et al. 体重減少によるカルシフィラキシー：マトリックスメタロプロテイナーゼの潜在的な役割。 J ダーマトール。 2003;30(12):915-919。
  6. シェーネ=クライン M-C. 「自然と合成の多光子のイメージ。 化粧品の評価を新たに行うのです。」 Photoniques 88 (2017): 21-24。
  7. 王、和群、他「人間の皮膚における真皮基質の加齢に伴う形態学的変化を、多光子顕微鏡によって生体内で記録した。」 生物医学光学ジャーナル 23.3 (2018): 030501。
  8. キュイ、ジェイソン Z. 他「多光子顕微鏡によるマルファン症候群の大動脈および皮膚のエラスチンおよびコラーゲンの形態の定量化」 構造生物学ジャーナル 187.3 (2014): 242-253。
  9. Tong、P.L.、他。 「多光子顕微鏡を使用したエラスチン関連疾患の組織病理学的解剖への定量的アプローチ」 英国皮膚科学会誌 169.4 (2013): 869-879。
  10. G. ドゥクルシアル、J.-S. アファガード、M. シュメルツ、X. ソリナス、M. ロペス=ポンセラ、C. ボノー=ビドー、R. ルビオ=アマドール、F. ルッジェーロ、J.-M. アラン、E. ボーペール、M.-C. Schanne-Klein、「高速偏光分解SHGイメージングによる皮膚伸張中の動的コラーゲン再組織化のモニタリング」 J.バイオフォト。 12、e201800336 (2019)。