Endring av dermale elastiske fibre under kalsifiserende dermatose: strukturell studie ved bruk av multifotonmikroskopi (Calciphoton)

Variasjonen av patologier ledsaget av mineralforekomster i vev er stor (kreft, infeksjonsprosesser, miljøsykdommer) (1). I dermatologi er flere patologier assosiert med kalsiummineralforekomster, som kalsifylakse og pseudoxanthoma elasticum (PXE). Til dags dato har få studier blitt utført på de kjemiske egenskapene til kutane mineralforekomster, deres fysiopatologiske konsekvenser, forekomsten av tilhørende patologier og deres konsekvenser for menneskelige organer.

Dette har motivert PhD-prosjektet til Hester COLBOC, M.D., om karakterisering av kalsiumavleiringer ved ulike forkalkende dermatose, inkludert kalsifylakse (2) og sarkoidose (3). Dette grunnleggende forskningsprosjektet er utført innenfor rammen av et samarbeid mellom LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) og AP-HP, spesielt innen uro-nefrologi (urinary lithiasis) og onkologi (4) (forkalkninger i bryst- og skjoldbruskkjertelkreft). Vi har vist at hudforkalkninger består av karbapatitt ved kalsifylakse og kalsitt ved sarkoidose. Vi har også vist at disse avsetningene hovedsakelig er lokalisert i de elastiske fibrene i dermal eller karvegg, noe som antyder en molekylær kjernedannelsesvei i disse fibrene som skal utforskes.

Denne strukturelle og kjemiske beskrivelsen er nyskapende, men svarer ikke på alle spørsmålene som oppstår rundt disse kalsiumavleiringene: hvorfor har noen pasienter, som har en normal fosfokalsiumbalanse, massive hudforkalkninger? Hvorfor har andre pasienter, som noen dialysepasienter, tvert imot ekstremt forstyrrede fosfokalsiske balanser, men ingen hudforkalkning? Dette paradokset øker muligheten for eksistensen av "kjernedannelsesfoci" i de elastiske dermale og vaskulære fibrene, og favoriserer utfellingen av fosfokalsiske avleiringer hos noen pasienter. Noen in vitro-modeller har utforsket disse kjernedannelsesfokusene i elastiske fibre. (ref Gourgas et al) Ganske bemerkelsesverdig er de fleste forkalkende dermatose innledet av en kutan inflammatorisk tilstand. Disse hudinflammatoriske fenomenene kan også indusere utfelling av kalsiumavleiringer. Noen forfattere spekulerer dermed i at elastin fordøyes av metalloproteinase (MMP) i den ekstracellulære matrisen, og skaper dermed kjernedannelsesfokus som favoriserer fosfokalsiske avsetninger. Munavalli et al. viste et økt nivå av MMP i urinprøve hos en pasient med kalsifylakse i sammenheng med raskt vekttap (5). De antar at forhøyede MMP-nivåer i serum hos denne pasienten kan føre til en endring av den ytre elastiske grensen og vaskulære forkalkninger. Denne hypotesen støttes på den annen side av andre modeller for endring av elastiske fibre, for eksempel under aldring av huden (dermatoporose), der det ikke er noen betennelse og ingen forkalkning.

Bakgrunnshypotesen for prosjektet vårt er at hudbetennelse fører til en spesifikk endring av de elastiske fibrene, noe som bidrar til deres forkalkning.

For å utforske denne hypotesen, spesielt under kalsifylakse og PXE, foreslår vi å bruke multifotonmikroskopi, en avbildningsteknikk tilgjengelig ved Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) ved Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi er utviklet på begynnelsen av 1990-tallet som et alternativ til konfokalmikroskopi, for å forbedre dybdeavbildning av biologisk vev med submikrometrisk oppløsning. Det viktigste er at multifotonmikroskopi kan kombinere flere kontrastmengder parallelt og uten merking for å identifisere de ulike elementene i et vev. Second Harmonic Generation (SHG)-signaler tillater spesifikk avbildning av ufarget fibrillært kollagen med uovertruffen følsomhet, mens to-foton eksitert fluorescens (2PEF) tillater cellulær avbildning takket være ulike iboende cellulære kromoforer samt elastinavbildning i dermis eller i andre vev (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi har blitt brukt i flere studier på huden, inkludert ved LOB (se figur 1), som har bevist den høye relevansen til denne teknikken for strukturell karakterisering av dermale fibre, spesielt elastin- og kollagenfibre, og deres mulige endring. Det har blitt brukt til studiet av hudaldring, så vel som på patologier som fører til degenerasjon av elastiske (PXE) eller kollagenfibre (Marfan-syndrom) (7-9). Denne teknikken er derfor svært egnet for å utforske strukturen til elastiske fibre under kutane inflammatoriske fenomener og forkalkende dermatoser.

Parallelt vil den kutane inflammatoriske prosessen utforskes med andre metoder. Immuno-histokjemi vil bli brukt til å oppdage dermal MMP og røntgenfluorescens (ved Synchrotron Soleil, Diffabs linje) vil bli brukt til å bevise intradermale sink og andre metalliske avleiringer, som gjort i våre tidligere studier (Figur 2).

Figur 2: Røntgenfluorescens av en hudbiopsi: eksempel på korrelasjon mellom dermalt inflammatorisk infiltrat (A) og tilstedeværelsen av intradermal sink (B), her under en lichenoidreaksjon på tatovering (bilder tatt opp ved Soleil Synchrotron, Diffabs-linjen, av S. Reguer, D. Bazin og H. Colboc).

Hovedmålet med prosjektet vårt er å karakterisere de strukturelle endringene av elastiske fibre under forkalkende dermatose.

De sekundære målene er:

• å studere konsekvensene av kutane inflammatoriske prosesser på endring av elastiske fibre,
• å identifisere en mulig kjernedannelse foci for dannelsen av fosfo-kalsium avleiringer i de elastiske dermale og vaskulære fibrene.

Hudprøver. Studien skal hovedsakelig utføres på menneskelig hud, men også på en musemodell av PXE: ABCC6 KO mus. Mer presist vil materialet som studeres ved LOB være:

• Humane hudbiopsier som allerede er samlet inn for diagnostisering av disse forkalkende dermatosene: PXE, kalsifylakse, andre forkalkende inflammatoriske dermatoser (lupus panniculitis, dermatomyositis), fra patologilaboratoriet ved Tenon-sykehuset (Dr. Moguelet).
• Som kontroller, humane biopsier av sunn hud fra pasienter i forskjellige aldre, (margin for fjerning av hudtumor), fra Tenon Hospital. Vi vil fokusere på pasienter med avansert hudaldring, spesielt pasienter med solelastose. Denne modellen av UV-indusert endring av elastiske fibre er en god kontroll når det gjelder skader på ikke-inflammatoriske og ikke-kalsifiserte elastiske fibre.
• Kutane biopsier fra musemodellen til PXE (ABCC6 KO-mus) og fra matchede kontrollmus, fra INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoller. Alle disse biopsiene vil bli preget av multifotonmikroskopi ved å kombinere 2PEF og SHG kontraster for samtidig å avbilde elastiske og kollagenfibre. I et første trinn vil den eksperimentelle protokollen være som følger:

• Produksjon ved Tenon Hospital av flere serieglass fra hver biopsi: 1 ufarget ("hvit") objektglass for multifotonavbildning, 1 objektglass med vanlig morfologisk farging (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglass med farging som fremhever kalsiumavleiringer (Von Kossa) ) og 3 objektglass med immunhistokjemiske merkinger av de viktigste MMP-ene (antistoffer mot MMP-1, 2 og 9).
• avbildning ved LOB på et standard optisk lysfeltmikroskop (standard og polarisert transmittert lys, fluorescens, DIC) av alle de fargede lysbildene over et stort synsfelt ved mosaikk; identifikasjon av regioner av interesse (ROI) som tilsvarer inflammatoriske prosesser, vevsremodellering eller mineralforekomster. Merk at mineralforekomster avsløres av polarisert transmittert lys eller ved fasekontrast eller DIC.
• Røntgenfluorescensavbildning ved Soleil Synchrotron for å identifisere de metalliske avsetningene som er tilstede i biopsiene, spesielt sink. Dette skal gjøres i samarbeid med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en sterk ekspertise på mineralavbildning i Diffabs-linjen.
• Multifotonavbildning ved LOB av de identifiserte områdene av interesse, eller til og med på et stort synsfelt ved automatisk å sy flere fliser. Polarisasjonsoppløste bilder vil også bli utført i svært tette områder eller i ombygde områder for å kartlegge retningen til kollagen- og elastinfibre (10).
• Automatisert kvantitativ analyse av multifoton LOB-bilder for å måle flere parametere relatert til mengde og struktur av elastin. Automatiserte kvantitative analyser vil også bli utført på kollagen og andre strukturer av interesse observert på multifotonbilder eller histologiske bilder. Resultatene av de forskjellige bildemodalitetene vil bli korrelert på hver serie med lysbilder. Legg merke til at automatisk analyse er viktig både for å unngå de vanlige skjevhetene til semi-kvantitativ analyse og for å få mer informative strukturelle parametere. For eksempel vil følgende parametere trekkes ut fra elastinbildene: gjennomsnittlig tetthet av de elastiske fibrene (per cm², i papillærdermis og i retikulær dermis), orienteringsfordelingen til de elastiske fibrene, entropien og den sirkulære variansen av denne fordelingen, graden av krumning av de elastiske fibrene, deres avstand fra mineralforekomstene.
• Statistisk analyse av multimodale data, basert på passende statistiske tester. A priori ikke-parametriske tester (Wilcoxon-Mann-Whitney) vil bli brukt med tanke på det relativt lille antallet tilgjengelige humane prøver. Minimum 8 pasienter per gruppe vil bli studert, noe som bør være tilstrekkelig på grunn av nøyaktigheten og reproduserbarheten til de automatiserte målingene. Dersom flere prøver eller bildeserier utføres på samme pasient, vil nestede statistiske tester benyttes (nestede t-tester eller nestede Wilcoxon).

I et andre trinn og basert på resultatene fra det første trinnet, vil ulike elementer i denne protokollen bli forbedret for å få tilgang til mer informasjon:

• Multifotonavbildning vil bli utført i intakte murine hudbiopsier for å bedre fremheve 3D-organiseringen av elastin.
• Avansert fluorescensavbildning av betennelse vil bli utført i ex vivo murin hud, ved bruk av spektral- eller FLIM-målinger (fluorescens-lifetime imaging microscopy)

• Third Harmonic Generation (THG) vil bli brukt til å visualisere strukturen til mineralforekomstene.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering og noen fysisk-kjemiske aspekter ved patologiske mikrokalsifikasjoner. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.

Variasjonen av patologier ledsaget av mineralforekomster i vev er stor (kreft, infeksjonsprosesser, miljøsykdommer) (1). I dermatologi er flere patologier assosiert med kalsiummineralforekomster, som kalsifylakse og pseudoxanthoma elasticum (PXE). Til dags dato har få studier blitt utført på de kjemiske egenskapene til kutane mineralforekomster, deres fysiopatologiske konsekvenser, forekomsten av tilhørende patologier og deres konsekvenser for menneskelige organer.

Dette har motivert PhD-prosjektet til Hester COLBOC, M.D., om karakterisering av kalsiumavleiringer ved ulike forkalkende dermatose, inkludert kalsifylakse (2) og sarkoidose (3). Dette grunnleggende forskningsprosjektet er utført innenfor rammen av et samarbeid mellom LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) og AP-HP, spesielt innen uro-nefrologi (urinary lithiasis) og onkologi (4) (forkalkninger i bryst- og skjoldbruskkjertelkreft). Vi har vist at hudforkalkninger består av karbapatitt ved kalsifylakse og kalsitt ved sarkoidose. Vi har også vist at disse avsetningene hovedsakelig er lokalisert i de elastiske fibrene i dermal eller karvegg, noe som antyder en molekylær kjernedannelsesvei i disse fibrene som skal utforskes.

Denne strukturelle og kjemiske beskrivelsen er nyskapende, men svarer ikke på alle spørsmålene som oppstår rundt disse kalsiumavleiringene: hvorfor har noen pasienter, som har en normal fosfokalsiumbalanse, massive hudforkalkninger? Hvorfor har andre pasienter, som noen dialysepasienter, tvert imot ekstremt forstyrrede fosfokalsiske balanser, men ingen hudforkalkning? Dette paradokset øker muligheten for eksistensen av "kjernedannelsesfoci" i de elastiske dermale og vaskulære fibrene, og favoriserer utfellingen av fosfokalsiske avleiringer hos noen pasienter. Noen in vitro-modeller har utforsket disse kjernedannelsesfokusene i elastiske fibre. (ref Gourgas et al) Ganske bemerkelsesverdig er de fleste forkalkende dermatose innledet av en kutan inflammatorisk tilstand. Disse hudinflammatoriske fenomenene kan også indusere utfelling av kalsiumavleiringer. Noen forfattere spekulerer dermed i at elastin fordøyes av metalloproteinase (MMP) i den ekstracellulære matrisen, og skaper dermed kjernedannelsesfokus som favoriserer fosfokalsiske avsetninger. Munavalli et al. viste et økt nivå av MMP i urinprøve hos en pasient med kalsifylakse i sammenheng med raskt vekttap (5). De antar at forhøyede MMP-nivåer i serum hos denne pasienten kan føre til en endring av den ytre elastiske grensen og vaskulære forkalkninger. Denne hypotesen støttes på den annen side av andre modeller for endring av elastiske fibre, for eksempel under aldring av huden (dermatoporose), der det ikke er noen betennelse og ingen forkalkning.

Bakgrunnshypotesen for prosjektet vårt er at hudbetennelse fører til en spesifikk endring av de elastiske fibrene, noe som bidrar til deres forkalkning.

For å utforske denne hypotesen, spesielt under kalsifylakse og PXE, foreslår vi å bruke multifotonmikroskopi, en avbildningsteknikk tilgjengelig ved Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) ved Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi er utviklet på begynnelsen av 1990-tallet som et alternativ til konfokalmikroskopi, for å forbedre dybdeavbildning av biologisk vev med submikrometrisk oppløsning. Det viktigste er at multifotonmikroskopi kan kombinere flere kontrastmengder parallelt og uten merking for å identifisere de ulike elementene i et vev. Second Harmonic Generation (SHG)-signaler tillater spesifikk avbildning av ufarget fibrillært kollagen med uovertruffen følsomhet, mens to-foton eksitert fluorescens (2PEF) tillater cellulær avbildning takket være ulike iboende cellulære kromoforer samt elastinavbildning i dermis eller i andre vev (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi har blitt brukt i flere studier på huden, inkludert ved LOB (se figur 1), som har bevist den høye relevansen til denne teknikken for strukturell karakterisering av dermale fibre, spesielt elastin- og kollagenfibre, og deres mulige endring. Det har blitt brukt til studiet av hudaldring, så vel som på patologier som fører til degenerasjon av elastiske (PXE) eller kollagenfibre (Marfan-syndrom) (7-9). Denne teknikken er derfor svært egnet for å utforske strukturen til elastiske fibre under kutane inflammatoriske fenomener og forkalkende dermatoser.

Parallelt vil den kutane inflammatoriske prosessen utforskes med andre metoder. Immuno-histokjemi vil bli brukt til å oppdage dermal MMP og røntgenfluorescens (ved Synchrotron Soleil, Diffabs linje) vil bli brukt til å bevise intradermale sink og andre metalliske avleiringer, som gjort i våre tidligere studier (Figur 2).

Figur 2: Røntgenfluorescens av en hudbiopsi: eksempel på korrelasjon mellom dermalt inflammatorisk infiltrat (A) og tilstedeværelsen av intradermal sink (B), her under en lichenoidreaksjon på tatovering (bilder tatt opp ved Soleil Synchrotron, Diffabs-linjen, av S. Reguer, D. Bazin og H. Colboc).

Hovedmålet med prosjektet vårt er å karakterisere de strukturelle endringene av elastiske fibre under forkalkende dermatose.

De sekundære målene er:

• å studere konsekvensene av kutane inflammatoriske prosesser på endring av elastiske fibre,
• å identifisere en mulig kjernedannelse foci for dannelsen av fosfo-kalsium avleiringer i de elastiske dermale og vaskulære fibrene.

Hudprøver. Studien skal hovedsakelig utføres på menneskelig hud, men også på en musemodell av PXE: ABCC6 KO mus. Mer presist vil materialet som studeres ved LOB være:

• Humane hudbiopsier som allerede er samlet inn for diagnostisering av disse forkalkende dermatosene: PXE, kalsifylakse, andre forkalkende inflammatoriske dermatoser (lupus panniculitis, dermatomyositis), fra patologilaboratoriet ved Tenon-sykehuset (Dr. Moguelet).
• Som kontroller, humane biopsier av sunn hud fra pasienter i forskjellige aldre, (margin for fjerning av hudtumor), fra Tenon Hospital. Vi vil fokusere på pasienter med avansert hudaldring, spesielt pasienter med solelastose. Denne modellen av UV-indusert endring av elastiske fibre er en god kontroll når det gjelder skader på ikke-inflammatoriske og ikke-kalsifiserte elastiske fibre.
• Kutane biopsier fra musemodellen til PXE (ABCC6 KO-mus) og fra matchede kontrollmus, fra INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoller. Alle disse biopsiene vil bli preget av multifotonmikroskopi ved å kombinere 2PEF og SHG kontraster for samtidig å avbilde elastiske og kollagenfibre. I et første trinn vil den eksperimentelle protokollen være som følger:

• Produksjon ved Tenon Hospital av flere serieglass fra hver biopsi: 1 ufarget ("hvit") objektglass for multifotonavbildning, 1 objektglass med vanlig morfologisk farging (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglass med farging som fremhever kalsiumavleiringer (Von Kossa) ) og 3 objektglass med immunhistokjemiske merkinger av de viktigste MMP-ene (antistoffer mot MMP-1, 2 og 9).
• avbildning ved LOB på et standard optisk lysfeltmikroskop (standard og polarisert transmittert lys, fluorescens, DIC) av alle de fargede lysbildene over et stort synsfelt ved mosaikk; identifikasjon av regioner av interesse (ROI) som tilsvarer inflammatoriske prosesser, vevsremodellering eller mineralforekomster. Merk at mineralforekomster avsløres av polarisert transmittert lys eller ved fasekontrast eller DIC.
• Røntgenfluorescensavbildning ved Soleil Synchrotron for å identifisere de metalliske avsetningene som er tilstede i biopsiene, spesielt sink. Dette skal gjøres i samarbeid med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en sterk ekspertise på mineralavbildning i Diffabs-linjen.
• Multifotonavbildning ved LOB av de identifiserte områdene av interesse, eller til og med på et stort synsfelt ved automatisk å sy flere fliser. Polarisasjonsoppløste bilder vil også bli utført i svært tette områder eller i ombygde områder for å kartlegge retningen til kollagen- og elastinfibre (10).
• Automatisert kvantitativ analyse av multifoton LOB-bilder for å måle flere parametere relatert til mengde og struktur av elastin. Automatiserte kvantitative analyser vil også bli utført på kollagen og andre strukturer av interesse observert på multifotonbilder eller histologiske bilder. Resultatene av de forskjellige bildemodalitetene vil bli korrelert på hver serie med lysbilder. Legg merke til at automatisk analyse er viktig både for å unngå de vanlige skjevhetene til semi-kvantitativ analyse og for å få mer informative strukturelle parametere. For eksempel vil følgende parametere trekkes ut fra elastinbildene: gjennomsnittlig tetthet av de elastiske fibrene (per cm², i papillærdermis og i retikulær dermis), orienteringsfordelingen til de elastiske fibrene, entropien og den sirkulære variansen av denne fordelingen, graden av krumning av de elastiske fibrene, deres avstand fra mineralforekomstene.
• Statistisk analyse av multimodale data, basert på passende statistiske tester. A priori ikke-parametriske tester (Wilcoxon-Mann-Whitney) vil bli brukt med tanke på det relativt lille antallet tilgjengelige humane prøver. Minimum 8 pasienter per gruppe vil bli studert, noe som bør være tilstrekkelig på grunn av nøyaktigheten og reproduserbarheten til de automatiserte målingene. Dersom flere prøver eller bildeserier utføres på samme pasient, vil nestede statistiske tester benyttes (nestede t-tester eller nestede Wilcoxon).

I et andre trinn og basert på resultatene fra det første trinnet, vil ulike elementer i denne protokollen bli forbedret for å få tilgang til mer informasjon:

• Multifotonavbildning vil bli utført i intakte murine hudbiopsier for å bedre fremheve 3D-organiseringen av elastin.
• Avansert fluorescensavbildning av betennelse vil bli utført i ex vivo murin hud, ved bruk av spektral- eller FLIM-målinger (fluorescens-lifetime imaging microscopy)

• Third Harmonic Generation (THG) vil bli brukt til å visualisere strukturen til mineralforekomstene.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering og noen fysisk-kjemiske aspekter ved patologiske mikrokalsifikasjoner. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Lokalisering, morfologiske egenskaper og kjemisk sammensetning av kalsifylakse-relaterte hudavleiringer hos pasienter med kalsifisk uremisk arteriolopati. JAMA Dermatology 2019.
  3. H Colboc, et al. Fysisk-kjemisk karakterisering av uorganiske avleiringer assosiert med granulomer ved kutan sarkoidose. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2018.
  4. Haka AS, et al. Identifisering av mikrokalsifikasjoner i benigne og ondartede brystlesjoner ved å undersøke forskjeller i deres kjemiske sammensetning ved hjelp av Raman-spektroskopi. Kreft Res. 15 sept 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Vekttap-indusert kalsifylakse: potensiell rolle for matrisemetalloproteinaser. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Aldersrelaterte morfologiske endringer av dermal matrise i menneskelig hud dokumentert in vivo ved multifotonmikroskopi." Journal of biomedical optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Kvantifisering av aorta og kutan elastin og kollagenmorfologi i Marfans syndrom ved multifotonmikroskopi." Journal of structural biology 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "En kvantitativ tilnærming til histopatologisk disseksjon av elastinrelaterte lidelser ved bruk av multifotonmikroskopi." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire og M.-C. Schanne-Klein, "Overvåke dynamisk kollagenomorganisering under hudstrekking med rask polarisasjonsløst SHG-avbildning." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).