Altération des fibres élastiques dermiques au cours d'une dermatose calcifiante : étude structurale par microscopie multiphotonique (Calciphoton)

La variété des pathologies accompagnées de dépôts minéraux dans les tissus est grande (cancers, processus infectieux, maladies environnementales) (1). En dermatologie, plusieurs pathologies sont associées aux dépôts de minéraux calciques, telles que la calciphylaxie et le pseudoxanthome élastique (PXE). A ce jour, peu d'études ont été menées sur les caractéristiques chimiques des dépôts minéraux cutanés, leurs conséquences physiopathologiques, la survenue de pathologies associées et leurs répercussions sur les organes humains.

Cela a motivé le projet de doctorat de Hester COLBOC, M.D., sur la caractérisation des dépôts de calcium dans diverses dermatoses calcifiantes, y compris la calciphylaxie (2) et la sarcoïdose (3). Ce projet de recherche fondamentale est mené dans le cadre d'une collaboration entre le LCP (Institut de Physico-Chimie, CNRS, Université Paris-Saclay) et l'AP-HP, notamment dans les domaines de l'uro-néphrologie (lithiase urinaire) et de l'oncologie (4) (calcifications dans les cancers du sein et de la thyroïde). Nous avons montré que les calcifications cutanées sont constituées de carbapatite dans la calciphylaxie et de calcite dans la sarcoïdose. Nous avons également montré que ces dépôts sont principalement localisés dans les fibres élastiques du derme ou de la paroi vasculaire, suggérant une voie de nucléation moléculaire au sein de ces fibres à explorer.

Cette description structurale et chimique est innovante, mais ne répond pas à toutes les questions qui se posent autour de ces dépôts calciques : pourquoi certains patients, qui présentent un bilan phosphocalcique normal, présentent-ils des calcifications cutanées massives ? Pourquoi, au contraire, d'autres patients, comme certains dialysés, présentent-ils des bilans phosphocalciques extrêmement perturbés, mais pas de calcification cutanée ? Ce paradoxe évoque la possibilité de l'existence de « foyers de nucléation » au sein des fibres élastiques dermiques et vasculaires, favorisant la précipitation de dépôts phosphocalciques chez certains patients. Certains modèles in vitro ont exploré ces foyers de nucléation au sein des fibres élastiques. (ref Gourgas et al) De manière tout à fait remarquable, la plupart des dermatoses calcifiantes sont précédées d'un état inflammatoire cutané. Ces phénomènes inflammatoires cutanés pourraient également induire la précipitation de dépôts de calcium. Certains auteurs supposent ainsi que l'élastine est digérée par la métalloprotéinase (MMP) dans la matrice extracellulaire, créant ainsi des foyers de nucléation favorisant les dépôts phosphocalciques. Munavalli et al. ont montré une augmentation du taux de MMP dans l'échantillon urinaire d'un patient souffrant de calciphylaxie dans un contexte de perte de poids rapide (5). Ils émettent l'hypothèse que des taux sériques élevés de MMP chez ce patient pourraient entraîner une altération de la limite élastique externe et des calcifications vasculaires. Cette hypothèse est en revanche étayée par d'autres modèles d'altération des fibres élastiques, comme lors du vieillissement cutané (dermatoporose), dans lesquels il n'y a ni inflammation ni calcification.

L'hypothèse de base de notre projet est que l'inflammation cutanée entraîne une altération spécifique des fibres élastiques, propice à leur calcification.

Afin d'explorer cette hypothèse, notamment lors de la calciphylaxie et du PXE, nous proposons d'utiliser la microscopie multiphotonique, une technique d'imagerie disponible au Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) de l'Ecole Polytechnique. La microscopie multiphotonique a été développée au début des années 1990 comme alternative à la microscopie confocale, pour améliorer l'imagerie en profondeur des tissus biologiques avec une résolution sub-micrométrique. Surtout, la microscopie multiphotonique permet de combiner plusieurs filons de contraste en parallèle et sans aucun marquage pour identifier les différents éléments d'un tissu. Les signaux de génération de second harmonique (SHG) permettent une imagerie spécifique du collagène fibrillaire non coloré avec une sensibilité inégalée, tandis que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF) permet l'imagerie cellulaire grâce à divers chromophores cellulaires intrinsèques ainsi que l'imagerie de l'élastine dans le derme ou dans d'autres tissus (voir Figure 1) (6).

La microscopie multiphotonique a été utilisée dans plusieurs études sur la peau, y compris au LOB (voir Figure 1), qui ont prouvé la grande pertinence de cette technique pour la caractérisation structurale des fibres dermiques, en particulier les fibres d'élastine et de collagène, et leur éventuelle altération. Elle a été appliquée à l'étude du vieillissement cutané, ainsi qu'aux pathologies conduisant à la dégénérescence des fibres élastiques (PXE) ou de collagène (syndrome de Marfan) (7-9). Cette technique est donc tout à fait appropriée pour explorer la structure des fibres élastiques lors de phénomènes inflammatoires cutanés et de dermatoses calcifiantes.

En parallèle, le processus inflammatoire cutané sera exploré par d'autres méthodes. L'immuno-histochimie sera utilisée pour détecter les MMP dermiques et la fluorescence X (au Synchrotron Soleil, ligne Diffabs) sera utilisée pour mettre en évidence les dépôts intradermiques de zinc et d'autres dépôts métalliques, comme cela a été fait dans nos études précédentes (Figure 2).

Figure 2 : Fluorescence X d'une biopsie cutanée : exemple de corrélation entre infiltrat inflammatoire dermique (A) et présence de Zinc intradermique (B), ici lors d'une réaction lichénoïde sur tatouage (images enregistrées au Synchrotron Soleil, ligne Diffabs, par S. Reguer, D. Bazin et H. Colboc).

L'objectif principal de notre projet est de caractériser les altérations structurales des fibres élastiques au cours des dermatoses calcifiantes.

Les objectifs secondaires sont :

• étudier les conséquences des processus inflammatoires cutanés sur l'altération des fibres élastiques,
• identifier un éventuel foyer de nucléation pour la formation de dépôts phospho-calciques dans les fibres élastiques dermiques et vasculaires.

Échantillons de peau. L'étude sera principalement réalisée sur peau humaine, mais également sur un modèle murin de PXE : la souris ABCC6 KO. Plus précisément, le matériel étudié au LOB sera :

• Biopsies de peau humaine déjà collectées pour le diagnostic de ces dermatoses calcifiantes : PXE, calciphylaxie, autres dermatoses inflammatoires calcifiantes (lupus panniculite, dermatomyosite), auprès du laboratoire d'anatomo-pathologie de l'hôpital Tenon (Dr Moguelet).
• Comme témoins, des biopsies humaines de peau saine de patients d'âges différents, (marge d'ablation de la tumeur cutanée), de l'hôpital Tenon. Nous nous concentrerons sur les patients présentant un vieillissement cutané avancé, en particulier les patients présentant une élastose solaire. Ce modèle d'altération des fibres élastiques induite par les UV est un excellent contrôle en terme de dommages non inflammatoires et non calcifiés des fibres élastiques.
• Biopsies cutanées du modèle murin de PXE (souris ABCC6 KO) et de souris témoins appariées, de l'Unité INSERM 1155, Hôpital Tenon.

Protocoles. Toutes ces biopsies seront caractérisées par microscopie multiphotonique en combinant les contrastes 2PEF et SHG afin d'imager simultanément les fibres élastiques et collagènes. Dans un premier temps, le protocole expérimental sera le suivant :

• Production à l'hôpital Tenon de plusieurs lames en série de chaque biopsie : 1 lame non colorée ("blanche") pour imagerie multiphotonique, 1 lame avec coloration morphologique usuelle (hématoxyline-éosine-safran, HES), 1 lame avec coloration mettant en évidence les dépôts de calcium (Von Kossa ) et 3 lames avec des marquages ​​immuno-histochimiques des principaux MMP (anticorps contre MMP-1, 2 et 9).
• imagerie au LOB sur un microscope optique fond clair standard (lumière transmise standard et polarisée, fluorescence, DIC) de toutes les lames colorées sur un large champ de vision par mosaïquage ; identification de régions d'intérêt (ROI) correspondant à des processus inflammatoires, des remodelages tissulaires ou des gisements minéraux. A noter que les gisements minéraux sont révélés par lumière transmise polarisée ou par contraste de phase ou DIC.
• Imagerie de fluorescence X au Soleil Synchrotron pour identifier les dépôts métalliques présents dans les biopsies, notamment le Zinc. Cela se fera en collaboration avec Dominique Bazin (Institut de Physico-Chimie, CNRS, Université Paris-Saclay), qui possède une forte expertise en imagerie minérale dans la filière Diffabs.
• Imagerie multiphotonique au LOB des régions d'intérêt identifiées, voire sur un large champ de vision en assemblant automatiquement plusieurs tuiles. Des images résolues en polarisation seront également réalisées dans des zones très denses ou dans des zones remodelées afin de cartographier la direction des fibres de collagène et d'élastine (10).
• Analyse quantitative automatisée d'images LOB multiphotoniques pour mesurer plusieurs paramètres liés à la quantité et à la structure de l'élastine. Des analyses quantitatives automatisées seront également effectuées sur le collagène et d'autres structures d'intérêt observées sur des images multiphotoniques ou des images histologiques. Les résultats des différentes modalités d'imagerie seront corrélés sur chaque série de lames. Notez que l'analyse automatique est essentielle à la fois pour éviter les biais habituels de l'analyse semi-quantitative et pour obtenir des paramètres structuraux plus informatifs. Par exemple, les paramètres suivants seront extraits des images d'élastine : la densité moyenne des fibres élastiques (par cm², dans le derme papillaire et dans le derme réticulaire), la distribution d'orientation des fibres élastiques, l'entropie et la variance circulaire de cette distribution, le degré de courbure des fibres élastiques, leur éloignement des gisements minéraux.
• Analyse statistique des données multimodales, basée sur des tests statistiques appropriés. Des tests a priori non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney) seront utilisés compte tenu du nombre relativement faible d'échantillons humains disponibles. Un minimum de 8 patients par groupe sera étudié, ce qui devrait être suffisant en raison de la précision et de la reproductibilité des mesures automatisées. Si plusieurs prélèvements ou séries d'images sont réalisés sur un même patient, des tests statistiques imbriqués seront utilisés (tests t imbriqués ou Wilcoxon imbriqué).

Dans un second temps et en fonction des résultats de la première étape, différents éléments de ce protocole seront améliorés pour accéder à plus d'informations :

• L'imagerie multiphotonique sera réalisée dans des biopsies de peau murine intacte afin de mieux mettre en évidence l'organisation 3D de l'élastine.
• L'imagerie par fluorescence avancée de l'inflammation sera réalisée sur de la peau murine ex vivo, à l'aide de mesures spectrales ou FLIM (microscopie d'imagerie à durée de vie par fluorescence)

• La troisième génération d'harmoniques (THG) sera utilisée pour visualiser la structure des gisements minéraux.

  1. Bazin D, et al. Caractérisation et quelques aspects physicochimiques des microcalcifications pathologiques. Chem Rev. 10 octobre 2012 ;112(10):5092-120.

La variété des pathologies accompagnées de dépôts minéraux dans les tissus est grande (cancers, processus infectieux, maladies environnementales) (1). En dermatologie, plusieurs pathologies sont associées aux dépôts de minéraux calciques, telles que la calciphylaxie et le pseudoxanthome élastique (PXE). A ce jour, peu d'études ont été menées sur les caractéristiques chimiques des dépôts minéraux cutanés, leurs conséquences physiopathologiques, la survenue de pathologies associées et leurs répercussions sur les organes humains.

Cela a motivé le projet de doctorat de Hester COLBOC, M.D., sur la caractérisation des dépôts de calcium dans diverses dermatoses calcifiantes, y compris la calciphylaxie (2) et la sarcoïdose (3). Ce projet de recherche fondamentale est mené dans le cadre d'une collaboration entre le LCP (Institut de Physico-Chimie, CNRS, Université Paris-Saclay) et l'AP-HP, notamment dans les domaines de l'uro-néphrologie (lithiase urinaire) et de l'oncologie (4) (calcifications dans les cancers du sein et de la thyroïde). Nous avons montré que les calcifications cutanées sont constituées de carbapatite dans la calciphylaxie et de calcite dans la sarcoïdose. Nous avons également montré que ces dépôts sont principalement localisés dans les fibres élastiques du derme ou de la paroi vasculaire, suggérant une voie de nucléation moléculaire au sein de ces fibres à explorer.

Cette description structurale et chimique est innovante, mais ne répond pas à toutes les questions qui se posent autour de ces dépôts calciques : pourquoi certains patients, qui présentent un bilan phosphocalcique normal, présentent-ils des calcifications cutanées massives ? Pourquoi, au contraire, d'autres patients, comme certains dialysés, présentent-ils des bilans phosphocalciques extrêmement perturbés, mais pas de calcification cutanée ? Ce paradoxe évoque la possibilité de l'existence de « foyers de nucléation » au sein des fibres élastiques dermiques et vasculaires, favorisant la précipitation de dépôts phosphocalciques chez certains patients. Certains modèles in vitro ont exploré ces foyers de nucléation au sein des fibres élastiques. (ref Gourgas et al) De manière tout à fait remarquable, la plupart des dermatoses calcifiantes sont précédées d'un état inflammatoire cutané. Ces phénomènes inflammatoires cutanés pourraient également induire la précipitation de dépôts de calcium. Certains auteurs supposent ainsi que l'élastine est digérée par la métalloprotéinase (MMP) dans la matrice extracellulaire, créant ainsi des foyers de nucléation favorisant les dépôts phosphocalciques. Munavalli et al. ont montré une augmentation du taux de MMP dans l'échantillon urinaire d'un patient souffrant de calciphylaxie dans un contexte de perte de poids rapide (5). Ils émettent l'hypothèse que des taux sériques élevés de MMP chez ce patient pourraient entraîner une altération de la limite élastique externe et des calcifications vasculaires. Cette hypothèse est en revanche étayée par d'autres modèles d'altération des fibres élastiques, comme lors du vieillissement cutané (dermatoporose), dans lesquels il n'y a ni inflammation ni calcification.

L'hypothèse de base de notre projet est que l'inflammation cutanée entraîne une altération spécifique des fibres élastiques, propice à leur calcification.

Afin d'explorer cette hypothèse, notamment lors de la calciphylaxie et du PXE, nous proposons d'utiliser la microscopie multiphotonique, une technique d'imagerie disponible au Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) de l'Ecole Polytechnique. La microscopie multiphotonique a été développée au début des années 1990 comme alternative à la microscopie confocale, pour améliorer l'imagerie en profondeur des tissus biologiques avec une résolution sub-micrométrique. Surtout, la microscopie multiphotonique permet de combiner plusieurs filons de contraste en parallèle et sans aucun marquage pour identifier les différents éléments d'un tissu. Les signaux de génération de second harmonique (SHG) permettent une imagerie spécifique du collagène fibrillaire non coloré avec une sensibilité inégalée, tandis que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF) permet l'imagerie cellulaire grâce à divers chromophores cellulaires intrinsèques ainsi que l'imagerie de l'élastine dans le derme ou dans d'autres tissus (voir Figure 1) (6).

La microscopie multiphotonique a été utilisée dans plusieurs études sur la peau, y compris au LOB (voir Figure 1), qui ont prouvé la grande pertinence de cette technique pour la caractérisation structurale des fibres dermiques, en particulier les fibres d'élastine et de collagène, et leur éventuelle altération. Elle a été appliquée à l'étude du vieillissement cutané, ainsi qu'aux pathologies conduisant à la dégénérescence des fibres élastiques (PXE) ou de collagène (syndrome de Marfan) (7-9). Cette technique est donc tout à fait appropriée pour explorer la structure des fibres élastiques lors de phénomènes inflammatoires cutanés et de dermatoses calcifiantes.

En parallèle, le processus inflammatoire cutané sera exploré par d'autres méthodes. L'immuno-histochimie sera utilisée pour détecter les MMP dermiques et la fluorescence X (au Synchrotron Soleil, ligne Diffabs) sera utilisée pour mettre en évidence les dépôts intradermiques de zinc et d'autres dépôts métalliques, comme cela a été fait dans nos études précédentes (Figure 2).

Figure 2 : Fluorescence X d'une biopsie cutanée : exemple de corrélation entre infiltrat inflammatoire dermique (A) et présence de Zinc intradermique (B), ici lors d'une réaction lichénoïde sur tatouage (images enregistrées au Synchrotron Soleil, ligne Diffabs, par S. Reguer, D. Bazin et H. Colboc).

L'objectif principal de notre projet est de caractériser les altérations structurales des fibres élastiques au cours des dermatoses calcifiantes.

Les objectifs secondaires sont :

• étudier les conséquences des processus inflammatoires cutanés sur l'altération des fibres élastiques,
• identifier un éventuel foyer de nucléation pour la formation de dépôts phospho-calciques dans les fibres élastiques dermiques et vasculaires.

Échantillons de peau. L'étude sera principalement réalisée sur peau humaine, mais également sur un modèle murin de PXE : la souris ABCC6 KO. Plus précisément, le matériel étudié au LOB sera :

• Biopsies de peau humaine déjà collectées pour le diagnostic de ces dermatoses calcifiantes : PXE, calciphylaxie, autres dermatoses inflammatoires calcifiantes (lupus panniculite, dermatomyosite), auprès du laboratoire d'anatomo-pathologie de l'hôpital Tenon (Dr Moguelet).
• Comme témoins, des biopsies humaines de peau saine de patients d'âges différents, (marge d'ablation de la tumeur cutanée), de l'hôpital Tenon. Nous nous concentrerons sur les patients présentant un vieillissement cutané avancé, en particulier les patients présentant une élastose solaire. Ce modèle d'altération des fibres élastiques induite par les UV est un excellent contrôle en terme de dommages non inflammatoires et non calcifiés des fibres élastiques.
• Biopsies cutanées du modèle murin de PXE (souris ABCC6 KO) et de souris témoins appariées, de l'Unité INSERM 1155, Hôpital Tenon.

Protocoles. Toutes ces biopsies seront caractérisées par microscopie multiphotonique en combinant les contrastes 2PEF et SHG afin d'imager simultanément les fibres élastiques et collagènes. Dans un premier temps, le protocole expérimental sera le suivant :

• Production à l'hôpital Tenon de plusieurs lames en série de chaque biopsie : 1 lame non colorée ("blanche") pour imagerie multiphotonique, 1 lame avec coloration morphologique usuelle (hématoxyline-éosine-safran, HES), 1 lame avec coloration mettant en évidence les dépôts de calcium (Von Kossa ) et 3 lames avec des marquages ​​immuno-histochimiques des principaux MMP (anticorps contre MMP-1, 2 et 9).
• imagerie au LOB sur un microscope optique fond clair standard (lumière transmise standard et polarisée, fluorescence, DIC) de toutes les lames colorées sur un large champ de vision par mosaïquage ; identification de régions d'intérêt (ROI) correspondant à des processus inflammatoires, des remodelages tissulaires ou des gisements minéraux. A noter que les gisements minéraux sont révélés par lumière transmise polarisée ou par contraste de phase ou DIC.
• Imagerie de fluorescence X au Soleil Synchrotron pour identifier les dépôts métalliques présents dans les biopsies, notamment le Zinc. Cela se fera en collaboration avec Dominique Bazin (Institut de Physico-Chimie, CNRS, Université Paris-Saclay), qui possède une forte expertise en imagerie minérale dans la filière Diffabs.
• Imagerie multiphotonique au LOB des régions d'intérêt identifiées, voire sur un large champ de vision en assemblant automatiquement plusieurs tuiles. Des images résolues en polarisation seront également réalisées dans des zones très denses ou dans des zones remodelées afin de cartographier la direction des fibres de collagène et d'élastine (10).
• Analyse quantitative automatisée d'images LOB multiphotoniques pour mesurer plusieurs paramètres liés à la quantité et à la structure de l'élastine. Des analyses quantitatives automatisées seront également effectuées sur le collagène et d'autres structures d'intérêt observées sur des images multiphotoniques ou des images histologiques. Les résultats des différentes modalités d'imagerie seront corrélés sur chaque série de lames. Notez que l'analyse automatique est essentielle à la fois pour éviter les biais habituels de l'analyse semi-quantitative et pour obtenir des paramètres structuraux plus informatifs. Par exemple, les paramètres suivants seront extraits des images d'élastine : la densité moyenne des fibres élastiques (par cm², dans le derme papillaire et dans le derme réticulaire), la distribution d'orientation des fibres élastiques, l'entropie et la variance circulaire de cette distribution, le degré de courbure des fibres élastiques, leur éloignement des gisements minéraux.
• Analyse statistique des données multimodales, basée sur des tests statistiques appropriés. Des tests a priori non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney) seront utilisés compte tenu du nombre relativement faible d'échantillons humains disponibles. Un minimum de 8 patients par groupe sera étudié, ce qui devrait être suffisant en raison de la précision et de la reproductibilité des mesures automatisées. Si plusieurs prélèvements ou séries d'images sont réalisés sur un même patient, des tests statistiques imbriqués seront utilisés (tests t imbriqués ou Wilcoxon imbriqué).

Dans un second temps et en fonction des résultats de la première étape, différents éléments de ce protocole seront améliorés pour accéder à plus d'informations :

• L'imagerie multiphotonique sera réalisée dans des biopsies de peau murine intacte afin de mieux mettre en évidence l'organisation 3D de l'élastine.
• L'imagerie par fluorescence avancée de l'inflammation sera réalisée sur de la peau murine ex vivo, à l'aide de mesures spectrales ou FLIM (microscopie d'imagerie à durée de vie par fluorescence)

• La troisième génération d'harmoniques (THG) sera utilisée pour visualiser la structure des gisements minéraux.

  1. Bazin D, et al. Caractérisation et quelques aspects physicochimiques des microcalcifications pathologiques. Chem Rev. 10 octobre 2012 ;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Localisation, caractéristiques morphologiques et composition chimique des dépôts cutanés liés à la calciphylaxie chez les patients atteints d'artériolopathie urémique calcifiante. JAMA Dermatologie 2019.
  3. H Colboc, et al. Caractérisation physicochimique des dépôts inorganiques associés aux granulomes dans la sarcoïdose cutanée. Journal de l'Académie européenne de dermatologie et de vénéréologie 2018.
  4. Haka AS, et al. Identification des microcalcifications dans les lésions mammaires bénignes et malignes en sondant les différences de leur composition chimique à l'aide de la spectroscopie Raman. Cancer Rés. 15 septembre 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Calciphylaxie induite par la perte de poids : rôle potentiel des métalloprotéinases matricielles. J. Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017) : 21-24.
  7. Wang, Hequn et al. "Modifications morphologiques liées à l'âge de la matrice dermique de la peau humaine documentées in vivo par microscopie multiphotonique." Journal d'optique biomédicale 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Quantification de la morphologie aortique et cutanée de l'élastine et du collagène dans le syndrome de Marfan par microscopie multiphotonique." Tourillon de biologie structurale 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "Une approche quantitative de la dissection histopathologique des troubles liés à l'élastine à l'aide de la microscopie multiphotonique." Journal britannique de dermatologie 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire et M.-C. Schanne-Klein, "Surveillance de la réorganisation dynamique du collagène pendant l'étirement de la peau avec une imagerie SHG à résolution de polarisation rapide." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).