Alterazione delle fibre elastiche dermiche durante la dermatosi calcificante: studio strutturale mediante microscopia multifotonica (Calciphoton)

La varietà di patologie accompagnate da depositi minerali nei tessuti è ampia (tumori, processi infettivi, malattie ambientali) (1). In dermatologia, diverse patologie sono associate ai depositi minerali di calcio, come la calcifilassi e lo pseudoxantoma elastico (PXE). Ad oggi sono pochi gli studi sulle caratteristiche chimiche dei depositi minerali cutanei, le loro conseguenze fisiopatologiche, l'insorgenza delle patologie associate e le loro ripercussioni sugli organi umani.

Ciò ha motivato il progetto di dottorato di Hester COLBOC, M.D., sulla caratterizzazione dei depositi di calcio in varie dermatosi calcificanti, tra cui la calcifilassi (2) e la sarcoidosi (3). Questo fondamentale progetto di ricerca si svolge nell'ambito di una collaborazione tra LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) e AP-HP, in particolare nei campi dell'uro-nefrologia (litiasi urinaria) e dell'oncologia (4) (calcificazioni nel cancro al seno e alla tiroide). Abbiamo dimostrato che le calcificazioni cutanee sono costituite da carbapatite nella calcifilassi e calcite nella sarcoidosi. Abbiamo anche dimostrato che questi depositi si trovano principalmente nelle fibre elastiche del derma o della parete vasale, suggerendo un percorso di nucleazione molecolare all'interno di queste fibre da esplorare.

Questa descrizione strutturale e chimica è innovativa, ma non risponde a tutte le domande che sorgono attorno a questi depositi di calcio: perché alcuni pazienti, che presentano un normale bilancio fosfocalcico, presentano massicce calcificazioni cutanee? Perché, al contrario, altri pazienti, come alcuni pazienti in dialisi, presentano bilanci fosfocalcici estremamente disturbati, ma nessuna calcificazione cutanea? Questo paradosso solleva la possibilità dell'esistenza di "focolai di nucleazione" all'interno delle fibre elastiche dermiche e vascolari, favorendo la precipitazione di depositi fosfocalcici in alcuni pazienti. Alcuni modelli in vitro hanno esplorato questi focolai di nucleazione all'interno delle fibre elastiche. (ref Gourgas et al) Abbastanza sorprendentemente, la maggior parte delle dermatosi calcificanti è preceduta da uno stato infiammatorio cutaneo. Questi fenomeni infiammatori cutanei potrebbero anche indurre la precipitazione di depositi di calcio. Alcuni autori ipotizzano quindi che l'elastina venga digerita dalla metalloproteinasi (MMP) nella matrice extracellulare, creando focolai di nucleazione che favoriscono i depositi fosfocalcici. Munavalli et al. ha mostrato un aumento del livello di MMP nel campione urinario di un paziente con calcifilassi in un contesto di rapida perdita di peso (5). Essi ipotizzano che elevati livelli sierici di MMP in questo paziente possano portare ad un'alterazione del limite elastico esterno ea calcificazioni vascolari. Questa ipotesi è supportata invece da altri modelli di alterazione delle fibre elastiche, come durante l'invecchiamento cutaneo (dermatoporosi), in cui non c'è infiammazione e nessuna calcificazione.

L'ipotesi di fondo del nostro progetto è che l'infiammazione cutanea porti ad una specifica alterazione delle fibre elastiche, che favorisce la loro calcificazione.

Per esplorare questa ipotesi, in particolare durante calcifilassi e PXE, proponiamo di utilizzare la microscopia multifotonica, una tecnica di imaging disponibile presso il Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) presso l'Ecole Polytechnique. La microscopia multifotonica è stata sviluppata nei primi anni '90 come alternativa alla microscopia confocale, per migliorare l'imaging in profondità dei tessuti biologici con risoluzione sub-micrometrica. Ancora più importante, la microscopia multifotonica può combinare diversi filoni di contrasto in parallelo e senza alcuna etichettatura per identificare i vari elementi di un tessuto. I segnali di generazione di seconda armonica (SHG) consentono l'imaging specifico del collagene fibrillare non colorato con una sensibilità senza pari, mentre la fluorescenza eccitata da due fotoni (2PEF) consente l'imaging cellulare grazie a vari cromofori cellulari intrinseci e l'imaging dell'elastina nel derma o in altri tessuti (vedi Figura 1) (6).

La microscopia multifotonica è stata utilizzata in diversi studi sulla pelle, anche a LOB (vedi Figura 1), che hanno dimostrato l'elevata rilevanza di questa tecnica per la caratterizzazione strutturale delle fibre dermiche, in particolare le fibre di elastina e collagene, e la loro possibile alterazione. È stato applicato allo studio dell'invecchiamento cutaneo, nonché a patologie che portano alla degenerazione delle fibre elastiche (PXE) o collagene (sindrome di Marfan) (7-9). Questa tecnica è quindi molto appropriata per esplorare la struttura delle fibre elastiche durante i fenomeni infiammatori cutanei e le dermatosi calcificanti.

Parallelamente, il processo infiammatorio cutaneo sarà esplorato con altri metodi. L'immuno-istochimica sarà utilizzata per rilevare la MMP dermica e la fluorescenza a raggi X (presso Synchrotron Soleil, linea Diffabs) sarà utilizzata per evidenziare lo zinco intradermico e altri depositi metallici, come fatto nei nostri studi precedenti (Figura 2).

Figura 2: Fluorescenza a raggi X di una biopsia cutanea: esempio di correlazione tra infiltrato infiammatorio dermico (A) e presenza di Zinco intradermico (B), qui durante una reazione lichenoide su tatuaggio (immagini registrate al Soleil Synchrotron, linea Diffabs, di S. Reguer, D. Bazin e H. Colboc).

L'obiettivo principale del nostro progetto è quello di caratterizzare le alterazioni strutturali delle fibre elastiche durante la dermatosi calcificante.

Gli obiettivi secondari sono:

• studiare le conseguenze dei processi infiammatori cutanei sull'alterazione delle fibre elastiche,
• identificare un possibile focolaio di nucleazione per la formazione di depositi fosfocalcici all'interno delle fibre elastiche dermiche e vascolari.

Campioni di pelle. Lo studio sarà condotto principalmente su pelle umana, ma anche su un modello murino di PXE: topo ABCC6 KO. Più precisamente, il materiale studiato presso LOB sarà:

• Biopsie cutanee umane già raccolte per la diagnosi di queste dermatosi calcificanti: PXE, calcifilassi, altre dermatosi infiammatorie calcificanti (lupus panniculite, dermatomiosite), dal laboratorio di patologia dell'ospedale di Tenon (Dr. Moguelet).
• Come controlli, biopsie umane di pelle sana di pazienti di diverse età, (margine di rimozione del tumore della pelle), dal Tenon Hospital. Ci concentreremo su pazienti con invecchiamento cutaneo avanzato, in particolare pazienti con elastosi solare. Questo modello di alterazione delle fibre elastiche indotta da UV è un ottimo controllo in termini di danni alle fibre elastiche non infiammatorie e non calcificate.
• Biopsie cutanee dal modello murino di PXE (topo ABCC6 KO) e da topi di controllo appaiati, dall'INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocolli. Tutte queste biopsie saranno caratterizzate mediante microscopia multifotonica combinando i contrasti 2PEF e SHG per visualizzare simultaneamente le fibre elastiche e collagene. In una prima fase, il protocollo sperimentale sarà il seguente:

• Produzione presso il Tenon Hospital di diversi vetrini in serie da ciascuna biopsia: 1 vetrino non colorato ("bianco") per imaging multifotone, 1 vetrino con colorazione morfologica abituale (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 vetrino con colorazione che evidenzia depositi di calcio (Von Kossa ) e 3 vetrini con marcature immunoistochimiche delle principali MMP (anticorpi contro MMP-1, 2 e 9).
• imaging a LOB su un microscopio ottico a campo chiaro standard (luce trasmessa standard e polarizzata, fluorescenza, DIC) di tutti i vetrini colorati su un ampio campo visivo mediante mosaicatura; identificazione di regioni di interesse (ROI) corrispondenti a processi infiammatori, rimodellamento tissutale o depositi minerali. Si noti che i depositi minerali sono rivelati dalla luce trasmessa polarizzata o dal contrasto di fase o DIC.
• Imaging a fluorescenza a raggi X al Soleil Synchrotron per identificare i depositi metallici presenti nelle biopsie, in particolare Zinco. Questo sarà fatto in collaborazione con Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), che ha una forte esperienza nell'imaging minerale nella linea Diffabs.
• Imaging multifotone a LOB delle regioni di interesse identificate, o anche su un ampio campo visivo mediante l'unione automatica di diverse tessere. Immagini risolte in polarizzazione saranno anche effettuate in aree molto dense o in aree rimodellate per mappare la direzione delle fibre di collagene ed elastina (10).
• Analisi quantitativa automatizzata di immagini LOB multifotone per misurare diversi parametri relativi alla quantità e alla struttura dell'elastina. Verranno eseguite anche analisi quantitative automatizzate su collagene e altre strutture di interesse osservate su immagini multifotone o immagini istologiche. I risultati delle diverse modalità di imaging saranno correlati su ciascuna serie di vetrini. Si noti che l'analisi automatica è essenziale sia per evitare i soliti pregiudizi dell'analisi semi-quantitativa sia per ottenere parametri strutturali più informativi. Ad esempio, dalle immagini di elastina verranno estratti i seguenti parametri: la densità media delle fibre elastiche (per cm², nel derma papillare e nel derma reticolare), la distribuzione dell'orientamento delle fibre elastiche, l'entropia e la varianza circolare di questa distribuzione, il grado di curvatura delle fibre elastiche, la loro distanza dai depositi minerali.
• Analisi statistica di dati multimodali, sulla base di opportuni test statistici. Verranno utilizzati test a priori non parametrici (Wilcoxon-Mann-Whitney) in considerazione del numero relativamente ridotto di campioni umani disponibili. Verranno studiati un minimo di 8 pazienti per gruppo, che dovrebbe essere sufficiente a causa dell'accuratezza e della riproducibilità delle misurazioni automatizzate. Se vengono eseguiti diversi campioni o serie di immagini sullo stesso paziente, verranno utilizzati test statistici nidificati (test t nidificati o Wilcoxon nidificato).

In una seconda fase e sulla base dei risultati della prima fase, varie voci di questo protocollo saranno migliorate per accedere a maggiori informazioni:

• L'imaging multifotone sarà eseguito su biopsie di pelle murina intatta per evidenziare meglio l'organizzazione 3D dell'elastina.
• L'imaging avanzato della fluorescenza dell'infiammazione sarà eseguito su pelle murina ex vivo, utilizzando misurazioni spettrali o FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)

• La generazione di terza armonica (THG) verrà utilizzata per visualizzare la struttura dei depositi minerali.

  1. Bazin D, et al. Caratterizzazione ed alcuni aspetti fisico-chimici delle microcalcificazioni patologiche. Chem Rev. 10 ott 2012;112(10):5092-120.

La varietà di patologie accompagnate da depositi minerali nei tessuti è ampia (tumori, processi infettivi, malattie ambientali) (1). In dermatologia, diverse patologie sono associate ai depositi minerali di calcio, come la calcifilassi e lo pseudoxantoma elastico (PXE). Ad oggi sono pochi gli studi sulle caratteristiche chimiche dei depositi minerali cutanei, le loro conseguenze fisiopatologiche, l'insorgenza delle patologie associate e le loro ripercussioni sugli organi umani.

Ciò ha motivato il progetto di dottorato di Hester COLBOC, M.D., sulla caratterizzazione dei depositi di calcio in varie dermatosi calcificanti, tra cui la calcifilassi (2) e la sarcoidosi (3). Questo fondamentale progetto di ricerca si svolge nell'ambito di una collaborazione tra LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) e AP-HP, in particolare nei campi dell'uro-nefrologia (litiasi urinaria) e dell'oncologia (4) (calcificazioni nel cancro al seno e alla tiroide). Abbiamo dimostrato che le calcificazioni cutanee sono costituite da carbapatite nella calcifilassi e calcite nella sarcoidosi. Abbiamo anche dimostrato che questi depositi si trovano principalmente nelle fibre elastiche del derma o della parete vasale, suggerendo un percorso di nucleazione molecolare all'interno di queste fibre da esplorare.

Questa descrizione strutturale e chimica è innovativa, ma non risponde a tutte le domande che sorgono attorno a questi depositi di calcio: perché alcuni pazienti, che presentano un normale bilancio fosfocalcico, presentano massicce calcificazioni cutanee? Perché, al contrario, altri pazienti, come alcuni pazienti in dialisi, presentano bilanci fosfocalcici estremamente disturbati, ma nessuna calcificazione cutanea? Questo paradosso solleva la possibilità dell'esistenza di "focolai di nucleazione" all'interno delle fibre elastiche dermiche e vascolari, favorendo la precipitazione di depositi fosfocalcici in alcuni pazienti. Alcuni modelli in vitro hanno esplorato questi focolai di nucleazione all'interno delle fibre elastiche. (ref Gourgas et al) Abbastanza sorprendentemente, la maggior parte delle dermatosi calcificanti è preceduta da uno stato infiammatorio cutaneo. Questi fenomeni infiammatori cutanei potrebbero anche indurre la precipitazione di depositi di calcio. Alcuni autori ipotizzano quindi che l'elastina venga digerita dalla metalloproteinasi (MMP) nella matrice extracellulare, creando focolai di nucleazione che favoriscono i depositi fosfocalcici. Munavalli et al. ha mostrato un aumento del livello di MMP nel campione urinario di un paziente con calcifilassi in un contesto di rapida perdita di peso (5). Essi ipotizzano che elevati livelli sierici di MMP in questo paziente possano portare ad un'alterazione del limite elastico esterno ea calcificazioni vascolari. Questa ipotesi è supportata invece da altri modelli di alterazione delle fibre elastiche, come durante l'invecchiamento cutaneo (dermatoporosi), in cui non c'è infiammazione e nessuna calcificazione.

L'ipotesi di fondo del nostro progetto è che l'infiammazione cutanea porti ad una specifica alterazione delle fibre elastiche, che favorisce la loro calcificazione.

Per esplorare questa ipotesi, in particolare durante calcifilassi e PXE, proponiamo di utilizzare la microscopia multifotonica, una tecnica di imaging disponibile presso il Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) presso l'Ecole Polytechnique. La microscopia multifotonica è stata sviluppata nei primi anni '90 come alternativa alla microscopia confocale, per migliorare l'imaging in profondità dei tessuti biologici con risoluzione sub-micrometrica. Ancora più importante, la microscopia multifotonica può combinare diversi filoni di contrasto in parallelo e senza alcuna etichettatura per identificare i vari elementi di un tessuto. I segnali di generazione di seconda armonica (SHG) consentono l'imaging specifico del collagene fibrillare non colorato con una sensibilità senza pari, mentre la fluorescenza eccitata da due fotoni (2PEF) consente l'imaging cellulare grazie a vari cromofori cellulari intrinseci e l'imaging dell'elastina nel derma o in altri tessuti (vedi Figura 1) (6).

La microscopia multifotonica è stata utilizzata in diversi studi sulla pelle, anche a LOB (vedi Figura 1), che hanno dimostrato l'elevata rilevanza di questa tecnica per la caratterizzazione strutturale delle fibre dermiche, in particolare le fibre di elastina e collagene, e la loro possibile alterazione. È stato applicato allo studio dell'invecchiamento cutaneo, nonché a patologie che portano alla degenerazione delle fibre elastiche (PXE) o collagene (sindrome di Marfan) (7-9). Questa tecnica è quindi molto appropriata per esplorare la struttura delle fibre elastiche durante i fenomeni infiammatori cutanei e le dermatosi calcificanti.

Parallelamente, il processo infiammatorio cutaneo sarà esplorato con altri metodi. L'immuno-istochimica sarà utilizzata per rilevare la MMP dermica e la fluorescenza a raggi X (presso Synchrotron Soleil, linea Diffabs) sarà utilizzata per evidenziare lo zinco intradermico e altri depositi metallici, come fatto nei nostri studi precedenti (Figura 2).

Figura 2: Fluorescenza a raggi X di una biopsia cutanea: esempio di correlazione tra infiltrato infiammatorio dermico (A) e presenza di Zinco intradermico (B), qui durante una reazione lichenoide su tatuaggio (immagini registrate al Soleil Synchrotron, linea Diffabs, di S. Reguer, D. Bazin e H. Colboc).

L'obiettivo principale del nostro progetto è quello di caratterizzare le alterazioni strutturali delle fibre elastiche durante la dermatosi calcificante.

Gli obiettivi secondari sono:

• studiare le conseguenze dei processi infiammatori cutanei sull'alterazione delle fibre elastiche,
• identificare un possibile focolaio di nucleazione per la formazione di depositi fosfocalcici all'interno delle fibre elastiche dermiche e vascolari.

Campioni di pelle. Lo studio sarà condotto principalmente su pelle umana, ma anche su un modello murino di PXE: topo ABCC6 KO. Più precisamente, il materiale studiato presso LOB sarà:

• Biopsie cutanee umane già raccolte per la diagnosi di queste dermatosi calcificanti: PXE, calcifilassi, altre dermatosi infiammatorie calcificanti (lupus panniculite, dermatomiosite), dal laboratorio di patologia dell'ospedale di Tenon (Dr. Moguelet).
• Come controlli, biopsie umane di pelle sana di pazienti di diverse età, (margine di rimozione del tumore della pelle), dal Tenon Hospital. Ci concentreremo su pazienti con invecchiamento cutaneo avanzato, in particolare pazienti con elastosi solare. Questo modello di alterazione delle fibre elastiche indotta da UV è un ottimo controllo in termini di danni alle fibre elastiche non infiammatorie e non calcificate.
• Biopsie cutanee dal modello murino di PXE (topo ABCC6 KO) e da topi di controllo appaiati, dall'INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocolli. Tutte queste biopsie saranno caratterizzate mediante microscopia multifotonica combinando i contrasti 2PEF e SHG per visualizzare simultaneamente le fibre elastiche e collagene. In una prima fase, il protocollo sperimentale sarà il seguente:

• Produzione presso il Tenon Hospital di diversi vetrini in serie da ciascuna biopsia: 1 vetrino non colorato ("bianco") per imaging multifotone, 1 vetrino con colorazione morfologica abituale (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 vetrino con colorazione che evidenzia depositi di calcio (Von Kossa ) e 3 vetrini con marcature immunoistochimiche delle principali MMP (anticorpi contro MMP-1, 2 e 9).
• imaging a LOB su un microscopio ottico a campo chiaro standard (luce trasmessa standard e polarizzata, fluorescenza, DIC) di tutti i vetrini colorati su un ampio campo visivo mediante mosaicatura; identificazione di regioni di interesse (ROI) corrispondenti a processi infiammatori, rimodellamento tissutale o depositi minerali. Si noti che i depositi minerali sono rivelati dalla luce trasmessa polarizzata o dal contrasto di fase o DIC.
• Imaging a fluorescenza a raggi X al Soleil Synchrotron per identificare i depositi metallici presenti nelle biopsie, in particolare Zinco. Questo sarà fatto in collaborazione con Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), che ha una forte esperienza nell'imaging minerale nella linea Diffabs.
• Imaging multifotone a LOB delle regioni di interesse identificate, o anche su un ampio campo visivo mediante l'unione automatica di diverse tessere. Immagini risolte in polarizzazione saranno anche effettuate in aree molto dense o in aree rimodellate per mappare la direzione delle fibre di collagene ed elastina (10).
• Analisi quantitativa automatizzata di immagini LOB multifotone per misurare diversi parametri relativi alla quantità e alla struttura dell'elastina. Verranno eseguite anche analisi quantitative automatizzate su collagene e altre strutture di interesse osservate su immagini multifotone o immagini istologiche. I risultati delle diverse modalità di imaging saranno correlati su ciascuna serie di vetrini. Si noti che l'analisi automatica è essenziale sia per evitare i soliti pregiudizi dell'analisi semi-quantitativa sia per ottenere parametri strutturali più informativi. Ad esempio, dalle immagini di elastina verranno estratti i seguenti parametri: la densità media delle fibre elastiche (per cm², nel derma papillare e nel derma reticolare), la distribuzione dell'orientamento delle fibre elastiche, l'entropia e la varianza circolare di questa distribuzione, il grado di curvatura delle fibre elastiche, la loro distanza dai depositi minerali.
• Analisi statistica di dati multimodali, sulla base di opportuni test statistici. Verranno utilizzati test a priori non parametrici (Wilcoxon-Mann-Whitney) in considerazione del numero relativamente ridotto di campioni umani disponibili. Verranno studiati un minimo di 8 pazienti per gruppo, che dovrebbe essere sufficiente a causa dell'accuratezza e della riproducibilità delle misurazioni automatizzate. Se vengono eseguiti diversi campioni o serie di immagini sullo stesso paziente, verranno utilizzati test statistici nidificati (test t nidificati o Wilcoxon nidificato).

In una seconda fase e sulla base dei risultati della prima fase, varie voci di questo protocollo saranno migliorate per accedere a maggiori informazioni:

• L'imaging multifotone sarà eseguito su biopsie di pelle murina intatta per evidenziare meglio l'organizzazione 3D dell'elastina.
• L'imaging avanzato della fluorescenza dell'infiammazione sarà eseguito su pelle murina ex vivo, utilizzando misurazioni spettrali o FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)

• La generazione di terza armonica (THG) verrà utilizzata per visualizzare la struttura dei depositi minerali.

  1. Bazin D, et al. Caratterizzazione ed alcuni aspetti fisico-chimici delle microcalcificazioni patologiche. Chem Rev. 10 ott 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Localizzazione, caratteristiche morfologiche e composizione chimica dei depositi cutanei correlati alla calcifilassi in pazienti con arteriolopatia uremica calcifica. JAMA Dermatologia 2019.
  3. H Colboc, et al. Caratterizzazione fisico-chimica dei depositi inorganici associati ai granulomi nella sarcoidosi cutanea. Giornale dell'Accademia Europea di Dermatologia e Venereologia 2018.
  4. Haka AS, et al. Identificazione delle microcalcificazioni nelle lesioni mammarie benigne e maligne sondando le differenze nella loro composizione chimica utilizzando la spettroscopia Raman. ricerca sul cancro 15 settembre 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Calcifilassi indotta dalla perdita di peso: ruolo potenziale delle metalloproteinasi della matrice. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein MC. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nuovo strumento per la valutazione dei prodotti cosmetici." Fotoniche 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Cambiamenti morfologici legati all'età della matrice dermica nella pelle umana documentati in vivo mediante microscopia multifotonica". Rivista di ottica biomedica 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Quantificazione dell'elastina aortica e cutanea e della morfologia del collagene nella sindrome di Marfan mediante microscopia multifotonica". Rivista di biologia strutturale 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, PL, et al. "Un approccio quantitativo alla dissezione istopatologica dei disturbi legati all'elastina utilizzando la microscopia multifotonica". Giornale britannico di dermatologia 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.‑S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire e M.‑C. Schanne-Klein, "Monitoraggio della riorganizzazione dinamica del collagene durante l'allungamento della pelle con imaging SHG a risoluzione rapida della polarizzazione." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).