钙化性皮肤病期间真皮弹性纤维的改变：使用多光子显微镜的结构研究 (Calciphoton)

伴随着组织中矿物质沉积的病理种类繁多（癌症、感染过程、环境疾病）(1)。 在皮肤病学中，有几种病理与钙矿沉积有关，例如钙化防御和弹性假黄瘤 (PXE)。 迄今为止，关于皮肤矿藏的化学特性、它们的病理生理学后果、相关病理的发生及其对人体器官的影响的研究很少。

这激发了医学博士 Hester COLBOC 的博士项目，该项目研究了各种钙化性皮肤病中钙沉积的特征，包括钙化防御 (2) 和结节病 (3)。 该基础研究项目是在 LCP（物理化学研究所、CNRS、巴黎萨克莱大学）和 AP-HP 合作的框架内进行的，特别是在泌尿肾病学（尿路结石）和肿瘤学领域(4)（乳腺癌和甲状腺癌的钙化）。 我们已经表明，皮肤钙化由钙化防御中的碳磷灰石和结节病中的方解石组成。 我们还表明，这些沉积物主要位于真皮或血管壁弹性纤维中，表明这些纤维内的分子成核途径有待探索。

这种结构和化学描述是创新的，但没有回答围绕这些钙沉积物出现的所有问题：为什么一些表现出正常磷钙平衡的患者有大量皮肤钙化？ 为什么，相反，其他患者，如一些透析患者，表现出极度紊乱的磷钙平衡表，但没有皮肤钙化？ 这种悖论提出了在弹性真皮和血管纤维内存在“成核灶”的可能性，有利于一些患者的磷钙沉积物沉淀。 一些体外模型已经探索了弹性纤维内的这些成核焦点。 （参考 Gourgas 等人）非常值得注意的是，大多数钙化性皮肤病之前都有皮肤炎症状态。 这些皮肤炎症现象也可能诱发钙沉积物的沉淀。 因此，一些作者推测弹性蛋白被细胞外基质中的金属蛋白酶 (MMP) 消化，从而产生有利于磷钙沉积的成核灶。 穆纳瓦利等人。表明在快速减肥的情况下患有钙化防御的患者的尿样中 MMP 水平升高 (5)。 他们假设该患者血清 MMP 水平升高可能导致外部弹性极限和血管钙化的改变。 另一方面，这一假设得到其他弹性纤维改变模型的支持，例如在皮肤老化（皮肤疏松症）期间，其中没有炎症也没有钙化。

我们项目的背景假设是皮肤炎症导致弹性纤维的特定改变，这有利于它们的钙化。

为了探索这一假设，特别是在钙化防御和 PXE 期间，我们建议使用多光子显微镜，这是一种在 Ecole Polytechnique 的 Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) 提供的成像技术。 多光子显微镜是在 1990 年代初期开发的，作为共聚焦显微镜的替代品，以改善具有亚微米分辨率的生物组织的深度成像。 最重要的是，多光子显微镜可以并行组合多个对比度，无需任何标记来识别组织的各种元素。 二次谐波生成 (SHG) 信号允许以无与伦比的灵敏度对未染色的纤维胶原蛋白进行特异性成像，而双光子激发荧光 (2PEF) 允许细胞成像，这要归功于各种固有的细胞生色团以及真皮或其他组织中的弹性蛋白成像（参见图1）（6）。

多光子显微镜已用于多项皮肤研究，包括 LOB（参见图 1），证明该技术与真皮纤维（尤其是弹性蛋白和胶原纤维）的结构表征及其可能的改变具有高度相关性。 它已被应用于研究皮肤老化，以及导致弹性 (PXE) 或胶原纤维退化（马凡综合征）的病理学 (7-9)。 因此，该技术非常适合探索皮肤炎症现象和钙化性皮肤病期间弹性纤维的结构。

同时，将通过其他方法探索皮肤炎症过程。 免疫组织化学将用于检测真皮 MMP，X 射线荧光（在 Synchrotron Soleil，Diffabs 线）将用于证明真皮内锌和其他金属沉积物，正如我们之前的研究所做的那样（图 2）。

图 2：皮肤活检的 X 射线荧光：真皮炎症浸润 (A) 与真皮内锌 (B) 之间相关性的示例，此处是在纹身上的苔藓样反应期间（图像记录在 Soleil Synchrotron、Diffabs 线、 S. Reguer、D. Bazin 和 H. Colboc）。

我们项目的主要目标是表征钙化性皮肤病期间弹性纤维的结构变化。

次要目标是：

• 研究皮肤炎症过程对弹性纤维变化的影响，
• 以确定在弹性真皮和血管纤维内形成磷钙沉积物的可能成核灶。

皮肤样本。 该研究将主要在人类皮肤上进行，但也会在 PXE 小鼠模型：ABCC6 KO 小鼠上进行。 更准确地说，在 LOB 学习的材料将是：

• 已经从 Tenon 医院的病理实验室（Moguelet 博士）收集了用于诊断这些钙化性皮肤病的人体皮肤活检：PXE、钙化防御、其他钙化性炎症性皮肤病（狼疮性脂膜炎、皮肌炎）。
• 作为对照，来自 Tenon 医院的不同年龄患者的健康皮肤人体活检（皮肤肿瘤切除边缘）。 我们将专注于皮肤老化严重的患者，尤其是日光性弹性增生症患者。 这种紫外线诱导的弹性纤维改变模型在非炎症和非钙化弹性纤维损伤方面是一个很好的控制。
• 来自 Tenon 医院 INSERM 1155 单元的 PXE 小鼠模型（ABCC6 KO 小鼠）和匹配的对照小鼠的皮肤活检。

协议。 所有这些活组织检查都将通过结合 2PEF 和 SHG 对比的多光子显微镜进行表征，以便同时对弹性纤维和胶原纤维进行成像。 第一步，实验方案如下：

• 在 Tenon 医院从每次活检中制作几张连续载玻片：1 张未染色（“白色”）载玻片用于多光子成像，1 张载玻片采用常规形态学染色（苏木精-伊红 - 赛峰红，HES），1 张载玻片突出显示钙沉积物（Von Kossa） ) 和 3 张带有主要 MMP 免疫组织化学标记的载玻片（针对 MMP-1、2 和 9 的抗体）。
• 在标准明场光学显微镜（标准和偏振透射光、荧光、DIC）上通过镶嵌对大视野内的所有染色载玻片进行 LOB 成像；识别与炎症过程、组织重塑或矿藏相对应的感兴趣区域 (ROI)。 请注意，通过偏振透射光或相衬或 DIC 可以揭示矿床。
• Soleil 同步加速器的 X 射线荧光成像，用于识别活检组织中存在的金属沉积物，特别是锌。 这将与 Dominique Bazin（物理化学研究所、CNRS、巴黎萨克雷大学）合作完成，后者在 Diffabs 系列的矿物成像方面拥有丰富的专业知识。
• 在已识别的感兴趣区域的 LOB 上进行多光子成像，甚至可以通过自动拼接多个图块在大视场上进行多光子成像。 偏振分辨图像也将在非常密集的区域或重塑区域进行，以绘制胶原蛋白和弹性蛋白纤维的方向 (10)。
• 多光子 LOB 图像的自动定量分析，以测量与弹性蛋白的数量和结构相关的几个参数。 还将对在多光子图像或组织学图像上观察到的胶原蛋白和其他感兴趣的结构进行自动定量分析。 不同成像模式的结果将在每个系列的幻灯片上相互关联。 请注意，自动分析对于避免半定量分析的常见偏差和获得更多信息结构参数都是必不可少的。 例如，将从弹性蛋白图像中提取以下参数：弹性纤维的平均密度（每平方厘米，在乳头状真皮和网状真皮中）、弹性纤维的取向分布、熵和圆方差这种分布，弹性纤维的弯曲程度，它们与矿床的距离。
• 基于适当的统计检验的多模态数据的统计分析。 鉴于可用人类样本的数量相对较少，将使用先验非参数测试 (Wilcoxon-Mann-Whitney)。 每组至少 8 名患者将被研究，由于自动测量的准确性和可重复性，这应该足够了。 如果对同一患者执行多个样本或图像系列，将使用嵌套统计检验（嵌套 t 检验或嵌套 Wilcoxon）。

在第二步中，根据第一步的结果，将改进此协议的各个项目以获取更多信息：

• 将在完整的小鼠皮肤活组织检查中进行多光子成像，以更好地突出弹性蛋白的 3D 组织。
• 将使用光谱或 FLIM（荧光寿命成像显微镜）测量在体外小鼠皮肤中进行炎症的高级荧光成像

• 三次谐波生成 (THG) 将用于可视化矿床的结构。

  1. 巴赞 D 等人。 病理性微钙化的特征和一些物理化学方面。 化学修订版 2012 年 10 月 10 日；112(10):5092-120。

伴随着组织中矿物质沉积的病理种类繁多（癌症、感染过程、环境疾病）(1)。 在皮肤病学中，有几种病理与钙矿沉积有关，例如钙化防御和弹性假黄瘤 (PXE)。 迄今为止，关于皮肤矿藏的化学特性、它们的病理生理学后果、相关病理的发生及其对人体器官的影响的研究很少。

这激发了医学博士 Hester COLBOC 的博士项目，该项目研究了各种钙化性皮肤病中钙沉积的特征，包括钙化防御 (2) 和结节病 (3)。 该基础研究项目是在 LCP（物理化学研究所、CNRS、巴黎萨克莱大学）和 AP-HP 合作的框架内进行的，特别是在泌尿肾病学（尿路结石）和肿瘤学领域(4)（乳腺癌和甲状腺癌的钙化）。 我们已经表明，皮肤钙化由钙化防御中的碳磷灰石和结节病中的方解石组成。 我们还表明，这些沉积物主要位于真皮或血管壁弹性纤维中，表明这些纤维内的分子成核途径有待探索。

这种结构和化学描述是创新的，但没有回答围绕这些钙沉积物出现的所有问题：为什么一些表现出正常磷钙平衡的患者有大量皮肤钙化？ 为什么，相反，其他患者，如一些透析患者，表现出极度紊乱的磷钙平衡表，但没有皮肤钙化？ 这种悖论提出了在弹性真皮和血管纤维内存在“成核灶”的可能性，有利于一些患者的磷钙沉积物沉淀。 一些体外模型已经探索了弹性纤维内的这些成核焦点。 （参考 Gourgas 等人）非常值得注意的是，大多数钙化性皮肤病之前都有皮肤炎症状态。 这些皮肤炎症现象也可能诱发钙沉积物的沉淀。 因此，一些作者推测弹性蛋白被细胞外基质中的金属蛋白酶 (MMP) 消化，从而产生有利于磷钙沉积的成核灶。 穆纳瓦利等人。表明在快速减肥的情况下患有钙化防御的患者的尿样中 MMP 水平升高 (5)。 他们假设该患者血清 MMP 水平升高可能导致外部弹性极限和血管钙化的改变。 另一方面，这一假设得到其他弹性纤维改变模型的支持，例如在皮肤老化（皮肤疏松症）期间，其中没有炎症也没有钙化。

我们项目的背景假设是皮肤炎症导致弹性纤维的特定改变，这有利于它们的钙化。

为了探索这一假设，特别是在钙化防御和 PXE 期间，我们建议使用多光子显微镜，这是一种在 Ecole Polytechnique 的 Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) 提供的成像技术。 多光子显微镜是在 1990 年代初期开发的，作为共聚焦显微镜的替代品，以改善具有亚微米分辨率的生物组织的深度成像。 最重要的是，多光子显微镜可以并行组合多个对比度，无需任何标记来识别组织的各种元素。 二次谐波生成 (SHG) 信号允许以无与伦比的灵敏度对未染色的纤维胶原蛋白进行特异性成像，而双光子激发荧光 (2PEF) 允许细胞成像，这要归功于各种固有的细胞生色团以及真皮或其他组织中的弹性蛋白成像（参见图1）（6）。

多光子显微镜已用于多项皮肤研究，包括 LOB（参见图 1），证明该技术与真皮纤维（尤其是弹性蛋白和胶原纤维）的结构表征及其可能的改变具有高度相关性。 它已被应用于研究皮肤老化，以及导致弹性 (PXE) 或胶原纤维退化（马凡综合征）的病理学 (7-9)。 因此，该技术非常适合探索皮肤炎症现象和钙化性皮肤病期间弹性纤维的结构。

同时，将通过其他方法探索皮肤炎症过程。 免疫组织化学将用于检测真皮 MMP，X 射线荧光（在 Synchrotron Soleil，Diffabs 线）将用于证明真皮内锌和其他金属沉积物，正如我们之前的研究所做的那样（图 2）。

图 2：皮肤活检的 X 射线荧光：真皮炎症浸润 (A) 与真皮内锌 (B) 之间相关性的示例，此处是在纹身上的苔藓样反应期间（图像记录在 Soleil Synchrotron、Diffabs 线、 S. Reguer、D. Bazin 和 H. Colboc）。

我们项目的主要目标是表征钙化性皮肤病期间弹性纤维的结构变化。

次要目标是：

• 研究皮肤炎症过程对弹性纤维变化的影响，
• 以确定在弹性真皮和血管纤维内形成磷钙沉积物的可能成核灶。

皮肤样本。 该研究将主要在人类皮肤上进行，但也会在 PXE 小鼠模型：ABCC6 KO 小鼠上进行。 更准确地说，在 LOB 学习的材料将是：

• 已经从 Tenon 医院的病理实验室（Moguelet 博士）收集了用于诊断这些钙化性皮肤病的人体皮肤活检：PXE、钙化防御、其他钙化性炎症性皮肤病（狼疮性脂膜炎、皮肌炎）。
• 作为对照，来自 Tenon 医院的不同年龄患者的健康皮肤人体活检（皮肤肿瘤切除边缘）。 我们将专注于皮肤老化严重的患者，尤其是日光性弹性增生症患者。 这种紫外线诱导的弹性纤维改变模型在非炎症和非钙化弹性纤维损伤方面是一个很好的控制。
• 来自 Tenon 医院 INSERM 1155 单元的 PXE 小鼠模型（ABCC6 KO 小鼠）和匹配的对照小鼠的皮肤活检。

协议。 所有这些活组织检查都将通过结合 2PEF 和 SHG 对比的多光子显微镜进行表征，以便同时对弹性纤维和胶原纤维进行成像。 第一步，实验方案如下：

• 在 Tenon 医院从每次活检中制作几张连续载玻片：1 张未染色（“白色”）载玻片用于多光子成像，1 张载玻片采用常规形态学染色（苏木精-伊红 - 赛峰红，HES），1 张载玻片突出显示钙沉积物（Von Kossa） ) 和 3 张带有主要 MMP 免疫组织化学标记的载玻片（针对 MMP-1、2 和 9 的抗体）。
• 在标准明场光学显微镜（标准和偏振透射光、荧光、DIC）上通过镶嵌对大视野内的所有染色载玻片进行 LOB 成像；识别与炎症过程、组织重塑或矿藏相对应的感兴趣区域 (ROI)。 请注意，通过偏振透射光或相衬或 DIC 可以揭示矿床。
• Soleil 同步加速器的 X 射线荧光成像，用于识别活检组织中存在的金属沉积物，特别是锌。 这将与 Dominique Bazin（物理化学研究所、CNRS、巴黎萨克雷大学）合作完成，后者在 Diffabs 系列的矿物成像方面拥有丰富的专业知识。
• 在已识别的感兴趣区域的 LOB 上进行多光子成像，甚至可以通过自动拼接多个图块在大视场上进行多光子成像。 偏振分辨图像也将在非常密集的区域或重塑区域进行，以绘制胶原蛋白和弹性蛋白纤维的方向 (10)。
• 多光子 LOB 图像的自动定量分析，以测量与弹性蛋白的数量和结构相关的几个参数。 还将对在多光子图像或组织学图像上观察到的胶原蛋白和其他感兴趣的结构进行自动定量分析。 不同成像模式的结果将在每个系列的幻灯片上相互关联。 请注意，自动分析对于避免半定量分析的常见偏差和获得更多信息结构参数都是必不可少的。 例如，将从弹性蛋白图像中提取以下参数：弹性纤维的平均密度（每平方厘米，在乳头状真皮和网状真皮中）、弹性纤维的取向分布、熵和圆方差这种分布，弹性纤维的弯曲程度，它们与矿床的距离。
• 基于适当的统计检验的多模态数据的统计分析。 鉴于可用人类样本的数量相对较少，将使用先验非参数测试 (Wilcoxon-Mann-Whitney)。 每组至少 8 名患者将被研究，由于自动测量的准确性和可重复性，这应该足够了。 如果对同一患者执行多个样本或图像系列，将使用嵌套统计检验（嵌套 t 检验或嵌套 Wilcoxon）。

在第二步中，根据第一步的结果，将改进此协议的各个项目以获取更多信息：

• 将在完整的小鼠皮肤活组织检查中进行多光子成像，以更好地突出弹性蛋白的 3D 组织。
• 将使用光谱或 FLIM（荧光寿命成像显微镜）测量在体外小鼠皮肤中进行炎症的高级荧光成像

• 三次谐波生成 (THG) 将用于可视化矿床的结构。

  1. 巴赞 D 等人。 病理性微钙化的特征和一些物理化学方面。 化学修订版 2012 年 10 月 10 日；112(10):5092-120。
  2. H Colboc 等人。 钙化性尿毒症小动脉病患者钙化防御相关皮肤沉积物的定位、形态特征和化学成分。 JAMA 皮肤病学 2019。
  3. H Colboc 等人。 皮肤结节病中与肉芽肿相关的无机沉积物的理化特性。 欧洲皮肤病学和性病学会杂志 2018 年。
  4. Haka AS 等人。 通过使用拉曼光谱探测化学成分的差异来识别良性和恶性乳腺病变中的微钙化。 癌症研究。 2002 年 9 月 15 日；62(18)：5375-80。
  5. Munavalli G 等人。 体重减轻引起的钙化防御：基质金属蛋白酶的潜在作用。 J Dermatol。 2003；30(12)：915-919。
  6. Schanne-Klein M-C。 “L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques。 Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques”。 Photoniques 88 (2017)：21-24。
  7. 王和群等。 “通过多光子显微镜在体内记录人体皮肤真皮基质与年龄相关的形态学变化。” 生物医学光学杂志 23.3 (2018): 030501。
  8. Cui, Jason Z., 等人。 “通过多光子显微镜对马凡综合征中的主动脉和皮肤弹性蛋白和胶原蛋白形态进行量化。” 结构生物学杂志 187.3 (2014): 242-253。
  9. Tong, P. L., 等人。 “使用多光子显微镜对弹性蛋白相关疾病进行组织病理学解剖的定量方法。” 英国皮肤病学杂志 169.4 (2013)：869-879。
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard、M. Schmeltz、X. Solinas、M. Lopez-Poncelas、C. Bonod-Bidaud、R. Rubio-Amador、F. Ruggiero、J.-M. Allain、E. Beaurepaire 和 M.-C。 Schanne-Klein，“使用快速偏振分辨 SHG 成像监测皮肤拉伸过程中的动态胶原重组。” J.Biophot。 12, e201800336 (2019).