Veränderung dermaler elastischer Fasern während der kalzifizierenden Dermatose: Strukturstudie mittels Multiphotonenmikroskopie (Calciphoton)

Die Vielfalt der Pathologien, die mit Mineralablagerungen im Gewebe einhergehen, ist groß (Krebs, Infektionsprozesse, Umweltkrankheiten) (1). In der Dermatologie werden mehrere Pathologien mit Kalziumablagerungen in Verbindung gebracht, beispielsweise Calciphylaxie und Pseudoxanthoma elasticum (PXE). Bisher wurden nur wenige Studien zu den chemischen Eigenschaften kutaner Mineralablagerungen, ihren physiopathologischen Folgen, dem Auftreten damit verbundener Pathologien und ihren Auswirkungen auf menschliche Organe durchgeführt.

Dies hat das Doktorandenprojekt von Hester COLBOC, M.D., zur Charakterisierung von Kalziumablagerungen bei verschiedenen verkalkenden Dermatosen, einschließlich Calciphylaxie (2) und Sarkoidose (3), motiviert. Dieses grundlegende Forschungsprojekt wird im Rahmen einer Zusammenarbeit zwischen dem LCP (Institut für Physiko-Chemie, CNRS, Universität Paris-Saclay) und AP-HP durchgeführt, insbesondere in den Bereichen Uronephrologie (Urinlithiasis) und Onkologie (4) (Verkalkungen bei Brust- und Schilddrüsenkrebs). Wir haben gezeigt, dass Hautverkalkungen bei Calciphylaxie aus Carbapatit und bei Sarkoidose aus Calcit bestehen. Wir haben auch gezeigt, dass sich diese Ablagerungen hauptsächlich in den elastischen Fasern der Haut oder der Gefäßwand befinden, was darauf hindeutet, dass ein molekularer Keimbildungsweg innerhalb dieser Fasern untersucht werden muss.

Diese strukturelle und chemische Beschreibung ist innovativ, beantwortet aber nicht alle Fragen, die sich rund um diese Kalkablagerungen stellen: Warum kommt es bei manchen Patienten, die einen normalen Phosphokalziumhaushalt aufweisen, zu massiven Hautverkalkungen? Warum hingegen weisen andere Patienten, wie zum Beispiel einige Dialysepatienten, extrem gestörte Phosphokalziumbilanzen, aber keine Hautverkalkung auf? Dieses Paradoxon erhöht die Möglichkeit der Existenz von „Keimbildungsherden“ innerhalb der elastischen Haut- und Gefäßfasern, die bei einigen Patienten die Ausfällung von Phosphokalzsäureablagerungen begünstigen. Einige In-vitro-Modelle haben diese Keimbildungsherde in elastischen Fasern untersucht. (Ref. Gourgas et al.) Bemerkenswert ist, dass den meisten verkalkenden Dermatosen ein entzündlicher Zustand der Haut vorausgeht. Diese entzündlichen Phänomene der Haut können auch zur Bildung von Kalkablagerungen führen. Einige Autoren spekulieren daher, dass Elastin durch Metalloproteinase (MMP) in der extrazellulären Matrix verdaut wird und so Keimbildungsherde entstehen, die phosphokalzische Ablagerungen begünstigen. Munavalli et al. zeigten einen Anstieg des MMP-Spiegels in der Urinprobe eines Patienten mit Calciphylaxie im Zusammenhang mit schnellem Gewichtsverlust (5). Sie nehmen an, dass erhöhte Serum-MMP-Spiegel bei diesem Patienten zu einer Veränderung der äußeren Elastizitätsgrenze und Gefäßverkalkungen führen könnten. Diese Hypothese wird andererseits durch andere Modelle der elastischen Faserveränderung gestützt, beispielsweise während der Hautalterung (Dermatoporose), bei der es zu keiner Entzündung und keiner Verkalkung kommt.

Die Hintergrundhypothese unseres Projekts ist, dass Hautentzündungen zu einer spezifischen Veränderung der elastischen Fasern führen, die deren Verkalkung begünstigt.

Um diese Hypothese, insbesondere während der Calciphylaxie und PXE, zu untersuchen, schlagen wir den Einsatz der Multiphotonenmikroskopie vor, einer bildgebenden Technik, die am Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) der Ecole Polytechnique verfügbar ist. Die Multiphotonenmikroskopie wurde Anfang der 1990er Jahre als Alternative zur konfokalen Mikroskopie entwickelt, um die Tiefenabbildung biologischer Gewebe mit einer Auflösung im Submikrometerbereich zu verbessern. Am wichtigsten ist, dass die Multiphotonenmikroskopie mehrere Kontrastadern parallel und ohne jegliche Markierung kombinieren kann, um die verschiedenen Elemente eines Gewebes zu identifizieren. Signale der zweiten Harmonischen Generation (SHG) ermöglichen die spezifische Abbildung von ungefärbtem fibrillärem Kollagen mit beispielloser Empfindlichkeit, während die durch zwei Photonen angeregte Fluoreszenz (2PEF) dank verschiedener intrinsischer zellulärer Chromophore eine zelluläre Abbildung sowie eine Elastin-Abbildung in der Dermis oder in anderen Geweben ermöglicht (siehe Abbildung 1) (6).

Multiphotonenmikroskopie wurde in mehreren Studien an der Haut eingesetzt, unter anderem am LOB (siehe Abbildung 1), die die hohe Relevanz dieser Technik für die strukturelle Charakterisierung dermaler Fasern, insbesondere Elastin- und Kollagenfasern, und deren mögliche Veränderung bewiesen haben. Es wurde zur Untersuchung der Hautalterung sowie von Pathologien angewendet, die zur Degeneration elastischer (PXE) oder Kollagenfasern (Marfan-Syndrom) führen (7-9). Diese Technik eignet sich daher hervorragend zur Untersuchung der Struktur elastischer Fasern bei kutanen Entzündungsphänomenen und verkalkenden Dermatosen.

Parallel dazu wird der kutane Entzündungsprozess mit anderen Methoden untersucht. Immunhistochemie wird verwendet, um dermales MMP nachzuweisen, und Röntgenfluoreszenz (am Synchrotron Soleil, Diffabs-Linie) wird verwendet, um intradermale Zink- und andere metallische Ablagerungen nachzuweisen, wie in unseren vorherigen Studien (Abbildung 2).

Abbildung 2: Röntgenfluoreszenz einer Hautbiopsie: Beispiel für die Korrelation zwischen dermalem entzündlichem Infiltrat (A) und dem Vorhandensein von intradermalem Zink (B), hier während einer lichenoiden Reaktion auf einer Tätowierung (Bilder aufgenommen am Soleil Synchrotron, Diffabs-Linie, von S. Reguer, D. Bazin und H. Colboc).

Das Hauptziel unseres Projekts ist die Charakterisierung der Strukturveränderungen elastischer Fasern während der kalzifizierenden Dermatose.

Die sekundären Ziele sind:

• die Auswirkungen kutaner Entzündungsprozesse auf die Veränderung elastischer Fasern zu untersuchen,
• um mögliche Keimbildungsherde für die Bildung von Phospho-Kalzium-Ablagerungen innerhalb der elastischen dermalen und vaskulären Fasern zu identifizieren.

Hautproben. Die Studie wird hauptsächlich an menschlicher Haut, aber auch an einem Mausmodell der PXE: ABCC6 KO-Maus durchgeführt. Genauer gesagt wird das am LOB untersuchte Material sein:

• Zur Diagnose dieser verkalkenden Dermatosen wurden bereits menschliche Hautbiopsien entnommen: PXE, Calciphylaxie, andere verkalkende entzündliche Dermatosen (Lupus panniculitis, Dermatomyositis), aus dem Pathologielabor des Tenon-Krankenhauses (Dr. Moguelet).
• Als Kontrollen dienten menschliche Biopsien gesunder Haut von Patienten unterschiedlichen Alters (Rand der Hauttumorentfernung) aus dem Tenon Hospital. Wir werden uns auf Patienten mit fortgeschrittener Hautalterung konzentrieren, insbesondere auf Patienten mit solarer Elastose. Dieses Modell der UV-induzierten Veränderung der elastischen Fasern bietet eine hervorragende Kontrolle im Hinblick auf nicht entzündliche und nicht verkalkte Schäden an den elastischen Fasern.
• Hautbiopsien vom Mausmodell von PXE (ABCC6 KO-Maus) und von passenden Kontrollmäusen, von INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokolle. Alle diese Biopsien werden durch Multiphotonenmikroskopie charakterisiert, indem 2PEF- und SHG-Kontraste kombiniert werden, um gleichzeitig elastische und kollagene Fasern abzubilden. In einem ersten Schritt sieht das Versuchsprotokoll wie folgt aus:

• Herstellung mehrerer serieller Objektträger aus jeder Biopsie im Tenon Hospital: 1 ungefärbter („weißer“) Objektträger für die Multiphotonenbildgebung, 1 Objektträger mit üblicher morphologischer Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Safran, HES), 1 Objektträger mit Färbung, die Kalziumablagerungen hervorhebt (Von Kossa). ) und 3 Objektträger mit immunhistochemischen Markierungen der wichtigsten MMPs (Antikörper gegen MMP-1, 2 und 9).
• Abbildung aller gefärbten Objektträger über ein großes Sichtfeld durch Mosaikierung am LOB auf einem optischen Standard-Hellfeldmikroskop (Standard- und polarisiertes Durchlicht, Fluoreszenz, DIC); Identifizierung von Regionen von Interesse (ROI), die entzündlichen Prozessen, Gewebeumgestaltungen oder Mineralablagerungen entsprechen. Beachten Sie, dass Mineralablagerungen durch polarisiertes Durchlicht oder durch Phasenkontrast oder DIC sichtbar gemacht werden.
• Röntgenfluoreszenzbildgebung am Soleil Synchrotron zur Identifizierung der in den Biopsien vorhandenen metallischen Ablagerungen, insbesondere Zink. Dies wird in Zusammenarbeit mit Dominique Bazin (Institut für Physiko-Chemie, CNRS, Universität Paris-Saclay) erfolgen, der über eine starke Expertise in der Mineralbildgebung in der Diffabs-Reihe verfügt.
• Multiphotonen-Bildgebung im LOB der identifizierten Bereiche von Interesse oder sogar in einem großen Sichtfeld durch automatisches Zusammenfügen mehrerer Kacheln. Polarisationsaufgelöste Bilder werden auch in sehr dichten Bereichen oder in umgestalteten Bereichen durchgeführt, um die Richtung von Kollagen- und Elastinfasern abzubilden (10).
• Automatisierte quantitative Analyse von Multiphotonen-LOB-Bildern zur Messung mehrerer Parameter im Zusammenhang mit der Menge und Struktur von Elastin. Automatisierte quantitative Analysen werden auch an Kollagen und anderen interessierenden Strukturen durchgeführt, die auf Multiphotonenbildern oder histologischen Bildern beobachtet werden. Die Ergebnisse der verschiedenen Bildgebungsmodalitäten werden auf jeder Folienserie korreliert. Beachten Sie, dass eine automatische Analyse unerlässlich ist, um sowohl die üblichen Verzerrungen der semiquantitativen Analyse zu vermeiden als auch aussagekräftigere Strukturparameter zu erhalten. Aus den Elastinbildern werden beispielsweise folgende Parameter extrahiert: die mittlere Dichte der elastischen Fasern (pro cm², in der papillären Dermis und in der retikulären Dermis), die Orientierungsverteilung der elastischen Fasern, die Entropie und die zirkuläre Varianz Von dieser Verteilung hängt der Krümmungsgrad der elastischen Fasern und ihr Abstand zu den Mineralvorkommen ab.
• Statistische Analyse multimodaler Daten, basierend auf geeigneten statistischen Tests. Aufgrund der relativ geringen Anzahl verfügbarer menschlicher Proben werden a priori nichtparametrische Tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) verwendet. Es werden mindestens 8 Patienten pro Gruppe untersucht, was aufgrund der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der automatisierten Messungen ausreichend sein sollte. Wenn mehrere Proben oder Bildserien am selben Patienten durchgeführt werden, werden verschachtelte statistische Tests verwendet (verschachtelte t-Tests oder verschachtelte Wilcoxon-Tests).

In einem zweiten Schritt und basierend auf den Ergebnissen des ersten Schritts werden verschiedene Punkte dieses Protokolls verbessert, um Zugang zu mehr Informationen zu erhalten:

• In intakten Maushautbiopsien wird eine Multiphotonenbildgebung durchgeführt, um die 3D-Organisation von Elastin besser hervorzuheben.
• Mithilfe von Spektral- oder FLIM-Messungen (Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie) wird eine erweiterte Fluoreszenzbildgebung von Entzündungen in Ex-vivo-Mäusehaut durchgeführt

• Mithilfe der Third Harmonic Generation (THG) wird die Struktur der Mineralvorkommen sichtbar gemacht.

  1. Bazin D, et al. Charakterisierung und einige physikalisch-chemische Aspekte pathologischer Mikroverkalkungen. Chem Rev. 10. Okt. 2012;112(10):5092-120.

Die Vielfalt der Pathologien, die mit Mineralablagerungen im Gewebe einhergehen, ist groß (Krebs, Infektionsprozesse, Umweltkrankheiten) (1). In der Dermatologie werden mehrere Pathologien mit Kalziumablagerungen in Verbindung gebracht, beispielsweise Calciphylaxie und Pseudoxanthoma elasticum (PXE). Bisher wurden nur wenige Studien zu den chemischen Eigenschaften kutaner Mineralablagerungen, ihren physiopathologischen Folgen, dem Auftreten damit verbundener Pathologien und ihren Auswirkungen auf menschliche Organe durchgeführt.

Dies hat das Doktorandenprojekt von Hester COLBOC, M.D., zur Charakterisierung von Kalziumablagerungen bei verschiedenen verkalkenden Dermatosen, einschließlich Calciphylaxie (2) und Sarkoidose (3), motiviert. Dieses grundlegende Forschungsprojekt wird im Rahmen einer Zusammenarbeit zwischen dem LCP (Institut für Physiko-Chemie, CNRS, Universität Paris-Saclay) und AP-HP durchgeführt, insbesondere in den Bereichen Uronephrologie (Urinlithiasis) und Onkologie (4) (Verkalkungen bei Brust- und Schilddrüsenkrebs). Wir haben gezeigt, dass Hautverkalkungen bei Calciphylaxie aus Carbapatit und bei Sarkoidose aus Calcit bestehen. Wir haben auch gezeigt, dass sich diese Ablagerungen hauptsächlich in den elastischen Fasern der Haut oder der Gefäßwand befinden, was darauf hindeutet, dass ein molekularer Keimbildungsweg innerhalb dieser Fasern untersucht werden muss.

Diese strukturelle und chemische Beschreibung ist innovativ, beantwortet aber nicht alle Fragen, die sich rund um diese Kalkablagerungen stellen: Warum kommt es bei manchen Patienten, die einen normalen Phosphokalziumhaushalt aufweisen, zu massiven Hautverkalkungen? Warum hingegen weisen andere Patienten, wie zum Beispiel einige Dialysepatienten, extrem gestörte Phosphokalziumbilanzen, aber keine Hautverkalkung auf? Dieses Paradoxon erhöht die Möglichkeit der Existenz von „Keimbildungsherden“ innerhalb der elastischen Haut- und Gefäßfasern, die bei einigen Patienten die Ausfällung von Phosphokalzsäureablagerungen begünstigen. Einige In-vitro-Modelle haben diese Keimbildungsherde in elastischen Fasern untersucht. (Ref. Gourgas et al.) Bemerkenswert ist, dass den meisten verkalkenden Dermatosen ein entzündlicher Zustand der Haut vorausgeht. Diese entzündlichen Phänomene der Haut können auch zur Bildung von Kalkablagerungen führen. Einige Autoren spekulieren daher, dass Elastin durch Metalloproteinase (MMP) in der extrazellulären Matrix verdaut wird und so Keimbildungsherde entstehen, die phosphokalzische Ablagerungen begünstigen. Munavalli et al. zeigten einen Anstieg des MMP-Spiegels in der Urinprobe eines Patienten mit Calciphylaxie im Zusammenhang mit schnellem Gewichtsverlust (5). Sie nehmen an, dass erhöhte Serum-MMP-Spiegel bei diesem Patienten zu einer Veränderung der äußeren Elastizitätsgrenze und Gefäßverkalkungen führen könnten. Diese Hypothese wird andererseits durch andere Modelle der elastischen Faserveränderung gestützt, beispielsweise während der Hautalterung (Dermatoporose), bei der es zu keiner Entzündung und keiner Verkalkung kommt.

Die Hintergrundhypothese unseres Projekts ist, dass Hautentzündungen zu einer spezifischen Veränderung der elastischen Fasern führen, die deren Verkalkung begünstigt.

Um diese Hypothese, insbesondere während der Calciphylaxie und PXE, zu untersuchen, schlagen wir den Einsatz der Multiphotonenmikroskopie vor, einer bildgebenden Technik, die am Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) der Ecole Polytechnique verfügbar ist. Die Multiphotonenmikroskopie wurde Anfang der 1990er Jahre als Alternative zur konfokalen Mikroskopie entwickelt, um die Tiefenabbildung biologischer Gewebe mit einer Auflösung im Submikrometerbereich zu verbessern. Am wichtigsten ist, dass die Multiphotonenmikroskopie mehrere Kontrastadern parallel und ohne jegliche Markierung kombinieren kann, um die verschiedenen Elemente eines Gewebes zu identifizieren. Signale der zweiten Harmonischen Generation (SHG) ermöglichen die spezifische Abbildung von ungefärbtem fibrillärem Kollagen mit beispielloser Empfindlichkeit, während die durch zwei Photonen angeregte Fluoreszenz (2PEF) dank verschiedener intrinsischer zellulärer Chromophore eine zelluläre Abbildung sowie eine Elastin-Abbildung in der Dermis oder in anderen Geweben ermöglicht (siehe Abbildung 1) (6).

Multiphotonenmikroskopie wurde in mehreren Studien an der Haut eingesetzt, unter anderem am LOB (siehe Abbildung 1), die die hohe Relevanz dieser Technik für die strukturelle Charakterisierung dermaler Fasern, insbesondere Elastin- und Kollagenfasern, und deren mögliche Veränderung bewiesen haben. Es wurde zur Untersuchung der Hautalterung sowie von Pathologien angewendet, die zur Degeneration elastischer (PXE) oder Kollagenfasern (Marfan-Syndrom) führen (7-9). Diese Technik eignet sich daher hervorragend zur Untersuchung der Struktur elastischer Fasern bei kutanen Entzündungsphänomenen und verkalkenden Dermatosen.

Parallel dazu wird der kutane Entzündungsprozess mit anderen Methoden untersucht. Immunhistochemie wird verwendet, um dermales MMP nachzuweisen, und Röntgenfluoreszenz (am Synchrotron Soleil, Diffabs-Linie) wird verwendet, um intradermale Zink- und andere metallische Ablagerungen nachzuweisen, wie in unseren vorherigen Studien (Abbildung 2).

Abbildung 2: Röntgenfluoreszenz einer Hautbiopsie: Beispiel für die Korrelation zwischen dermalem entzündlichem Infiltrat (A) und dem Vorhandensein von intradermalem Zink (B), hier während einer lichenoiden Reaktion auf einer Tätowierung (Bilder aufgenommen am Soleil Synchrotron, Diffabs-Linie, von S. Reguer, D. Bazin und H. Colboc).

Das Hauptziel unseres Projekts ist die Charakterisierung der Strukturveränderungen elastischer Fasern während der kalzifizierenden Dermatose.

Die sekundären Ziele sind:

• die Auswirkungen kutaner Entzündungsprozesse auf die Veränderung elastischer Fasern zu untersuchen,
• um mögliche Keimbildungsherde für die Bildung von Phospho-Kalzium-Ablagerungen innerhalb der elastischen dermalen und vaskulären Fasern zu identifizieren.

Hautproben. Die Studie wird hauptsächlich an menschlicher Haut, aber auch an einem Mausmodell der PXE: ABCC6 KO-Maus durchgeführt. Genauer gesagt wird das am LOB untersuchte Material sein:

• Zur Diagnose dieser verkalkenden Dermatosen wurden bereits menschliche Hautbiopsien entnommen: PXE, Calciphylaxie, andere verkalkende entzündliche Dermatosen (Lupus panniculitis, Dermatomyositis), aus dem Pathologielabor des Tenon-Krankenhauses (Dr. Moguelet).
• Als Kontrollen dienten menschliche Biopsien gesunder Haut von Patienten unterschiedlichen Alters (Rand der Hauttumorentfernung) aus dem Tenon Hospital. Wir werden uns auf Patienten mit fortgeschrittener Hautalterung konzentrieren, insbesondere auf Patienten mit solarer Elastose. Dieses Modell der UV-induzierten Veränderung der elastischen Fasern bietet eine hervorragende Kontrolle im Hinblick auf nicht entzündliche und nicht verkalkte Schäden an den elastischen Fasern.
• Hautbiopsien vom Mausmodell von PXE (ABCC6 KO-Maus) und von passenden Kontrollmäusen, von INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokolle. Alle diese Biopsien werden durch Multiphotonenmikroskopie charakterisiert, indem 2PEF- und SHG-Kontraste kombiniert werden, um gleichzeitig elastische und kollagene Fasern abzubilden. In einem ersten Schritt sieht das Versuchsprotokoll wie folgt aus:

• Herstellung mehrerer serieller Objektträger aus jeder Biopsie im Tenon Hospital: 1 ungefärbter („weißer“) Objektträger für die Multiphotonenbildgebung, 1 Objektträger mit üblicher morphologischer Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Safran, HES), 1 Objektträger mit Färbung, die Kalziumablagerungen hervorhebt (Von Kossa). ) und 3 Objektträger mit immunhistochemischen Markierungen der wichtigsten MMPs (Antikörper gegen MMP-1, 2 und 9).
• Abbildung aller gefärbten Objektträger über ein großes Sichtfeld durch Mosaikierung am LOB auf einem optischen Standard-Hellfeldmikroskop (Standard- und polarisiertes Durchlicht, Fluoreszenz, DIC); Identifizierung von Regionen von Interesse (ROI), die entzündlichen Prozessen, Gewebeumgestaltungen oder Mineralablagerungen entsprechen. Beachten Sie, dass Mineralablagerungen durch polarisiertes Durchlicht oder durch Phasenkontrast oder DIC sichtbar gemacht werden.
• Röntgenfluoreszenzbildgebung am Soleil Synchrotron zur Identifizierung der in den Biopsien vorhandenen metallischen Ablagerungen, insbesondere Zink. Dies wird in Zusammenarbeit mit Dominique Bazin (Institut für Physiko-Chemie, CNRS, Universität Paris-Saclay) erfolgen, der über eine starke Expertise in der Mineralbildgebung in der Diffabs-Reihe verfügt.
• Multiphotonen-Bildgebung im LOB der identifizierten Bereiche von Interesse oder sogar in einem großen Sichtfeld durch automatisches Zusammenfügen mehrerer Kacheln. Polarisationsaufgelöste Bilder werden auch in sehr dichten Bereichen oder in umgestalteten Bereichen durchgeführt, um die Richtung von Kollagen- und Elastinfasern abzubilden (10).
• Automatisierte quantitative Analyse von Multiphotonen-LOB-Bildern zur Messung mehrerer Parameter im Zusammenhang mit der Menge und Struktur von Elastin. Automatisierte quantitative Analysen werden auch an Kollagen und anderen interessierenden Strukturen durchgeführt, die auf Multiphotonenbildern oder histologischen Bildern beobachtet werden. Die Ergebnisse der verschiedenen Bildgebungsmodalitäten werden auf jeder Folienserie korreliert. Beachten Sie, dass eine automatische Analyse unerlässlich ist, um sowohl die üblichen Verzerrungen der semiquantitativen Analyse zu vermeiden als auch aussagekräftigere Strukturparameter zu erhalten. Aus den Elastinbildern werden beispielsweise folgende Parameter extrahiert: die mittlere Dichte der elastischen Fasern (pro cm², in der papillären Dermis und in der retikulären Dermis), die Orientierungsverteilung der elastischen Fasern, die Entropie und die zirkuläre Varianz Von dieser Verteilung hängt der Krümmungsgrad der elastischen Fasern und ihr Abstand zu den Mineralvorkommen ab.
• Statistische Analyse multimodaler Daten, basierend auf geeigneten statistischen Tests. Aufgrund der relativ geringen Anzahl verfügbarer menschlicher Proben werden a priori nichtparametrische Tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) verwendet. Es werden mindestens 8 Patienten pro Gruppe untersucht, was aufgrund der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der automatisierten Messungen ausreichend sein sollte. Wenn mehrere Proben oder Bildserien am selben Patienten durchgeführt werden, werden verschachtelte statistische Tests verwendet (verschachtelte t-Tests oder verschachtelte Wilcoxon-Tests).

In einem zweiten Schritt und basierend auf den Ergebnissen des ersten Schritts werden verschiedene Punkte dieses Protokolls verbessert, um Zugang zu mehr Informationen zu erhalten:

• In intakten Maushautbiopsien wird eine Multiphotonenbildgebung durchgeführt, um die 3D-Organisation von Elastin besser hervorzuheben.
• Mithilfe von Spektral- oder FLIM-Messungen (Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie) wird eine erweiterte Fluoreszenzbildgebung von Entzündungen in Ex-vivo-Mäusehaut durchgeführt

• Mithilfe der Third Harmonic Generation (THG) wird die Struktur der Mineralvorkommen sichtbar gemacht.

  1. Bazin D, et al. Charakterisierung und einige physikalisch-chemische Aspekte pathologischer Mikroverkalkungen. Chem Rev. 10. Okt. 2012;112(10):5092-120.
  2. H. Colboc et al. Lokalisierung, morphologische Merkmale und chemische Zusammensetzung von Calciphylaxie-bedingten Hautablagerungen bei Patienten mit kalkurämischer Arteriolopathie. JAMA Dermatologie 2019.
  3. H. Colboc et al. Physikochemische Charakterisierung anorganischer Ablagerungen im Zusammenhang mit Granulomen bei kutaner Sarkoidose. Zeitschrift der Europäischen Akademie für Dermatologie und Venerologie 2018.
  4. Haka AS, et al. Identifizierung von Mikroverkalkungen in gutartigen und bösartigen Brustläsionen durch Untersuchung von Unterschieden in ihrer chemischen Zusammensetzung mithilfe der Raman-Spektroskopie. Krebs Res. 15. September 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Durch Gewichtsverlust induzierte Calciphylaxie: mögliche Rolle von Matrixmetalloproteinasen. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. „L'imagerie multiphoton des peaux naturalelles et synthétiques. Ein neues Werkzeug zur Bewertung kosmetischer Produkte. Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn et al. „Altersbedingte morphologische Veränderungen der dermalen Matrix in der menschlichen Haut, in vivo durch Multiphotonenmikroskopie dokumentiert.“ Zeitschrift für biomedizinische Optik 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. „Quantifizierung der Elastin- und Kollagenmorphologie der Aorta und der Haut beim Marfan-Syndrom durch Multiphotonenmikroskopie.“ Zeitschrift für Strukturbiologie 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P. L., et al. „Ein quantitativer Ansatz zur histopathologischen Dissektion von Elastin-bedingten Störungen mittels Multiphotonenmikroskopie.“ British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire und M.-C. Schanne-Klein, „Überwachung der dynamischen Kollagenreorganisation während der Hautdehnung mit schneller polarisationsaufgelöster SHG-Bildgebung.“ J. Biophot. 12, e201800336 (2019).