Ihon elastisten kuitujen muuttaminen kalkkiutuvan dermatoosin aikana: Rakennetutkimus monifotonimikroskoopilla (Calciphoton)

Erilaisia ​​patologioita, joihin liittyy mineraaliesiintymiä kudoksissa, on suuri (syövät, tartuntaprosessit, ympäristötaudit) (1). Dermatologiassa kalsiummineraalikertymiin liittyy useita patologioita, kuten kalsifylaksia ja pseudoxanthoma elasticum (PXE). Tähän mennessä on tehty vain vähän tutkimuksia ihon mineraaliesiintymien kemiallisista ominaisuuksista, niiden fysiopatologisista seurauksista, niihin liittyvien sairauksien esiintymisestä ja niiden vaikutuksista ihmiselimiin.

Tämä on motivoinut Hester COLBOC, M.D.:n tohtoriprojektia kalsiumkertymien karakterisoimiseksi erilaisissa kalkkeutuvissa dermatooseissa, mukaan lukien kalsifylaksia (2) ja sarkoidoosi (3). Tämä perustutkimusprojekti toteutetaan LCP:n (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) ja AP-HP:n yhteistyönä erityisesti uronefrologian (virtsan litiaasi) ja onkologian aloilla. (4) (kalkkeutumat rinta- ja kilpirauhassyövässä). Olemme osoittaneet, että ihon kalkkeutumat koostuvat karbapatiitista kalsifylaksissa ja kalsiitista sarkoidoosissa. Olemme myös osoittaneet, että nämä kerrostumat sijaitsevat pääasiassa ihon tai suonen seinämän elastisissa kuiduissa, mikä viittaa siihen, että näissä kuiduissa on tutkittava molekyylin nukleaatioreitti.

Tämä rakenteellinen ja kemiallinen kuvaus on innovatiivinen, mutta ei vastaa kaikkiin näihin kalsiumkertymiin liittyviin kysymyksiin: miksi joillakin potilailla, joilla on normaali fosfokalsiumtasapaino, on massiivisia kalkkeutumia ihossa? Miksi päinvastoin muilla potilailla, kuten joillakin dialyysipotilailla, on erittäin häiriintynyt fosfokalkkitasapaino, mutta ei ihon kalkkeutumista? Tämä paradoksi nostaa esiin mahdollisuuden "ydinpesäkkeiden" olemassaoloon elastisissa iho- ja verisuonikuiduissa, mikä suosii fosfokalkkikerrostumien saostumista joillakin potilailla. Jotkut in vitro -mallit ovat tutkineet näitä nukleaatiokeskuksia elastisten kuitujen sisällä. (viite Gourgas et al) On huomattavaa, että useimpia kalkkeutuvia ihottumia edeltää ihon tulehdustila. Nämä ihon tulehdusilmiöt voivat myös aiheuttaa kalsiumkertymien saostumista. Jotkut kirjoittajat spekuloivat siten, että metalloproteinaasi (MMP) pilkkoo elastiinia solunulkoisessa matriisissa, mikä luo nukleaatiopesäkkeitä, jotka suosivat fosfokalkkikertymiä. Munavalli et ai. osoitti kohonneen MMP-tason kalsifylaksiaa sairastavan potilaan virtsanäytteessä nopean painonpudotuksen yhteydessä (5). He olettavat, että kohonneet seerumin MMP-tasot tällä potilaalla voivat johtaa ulkoisen elastisuusrajan muutokseen ja verisuonten kalkkeutumiseen. Tätä hypoteesia tukevat toisaalta muut elastisten kuitujen muutosmallit, kuten ihon ikääntymisen aikana (dermatoporoosi), joissa ei ole tulehdusta eikä kalkkeutumista.

Projektimme taustaolettamuksena on, että ihotulehdus johtaa elastisten säikeiden spesifiseen muutokseen, mikä edistää niiden kalkkeutumista.

Tämän hypoteesin tutkimiseksi, erityisesti kalsifylaksian ja PXE:n aikana, ehdotamme monifotonimikroskoopin käyttöä, kuvantamistekniikkaa, joka on saatavilla Ecole Polytechniquen Laboratoire d'Optique et Biosciencesissa (LOB). Monifotomikroskopia on kehitetty 1990-luvun alussa vaihtoehtona konfokaalimikroskopialle parantamaan biologisten kudosten syvällistä kuvantamista submikrometrisellä resoluutiolla. Mikä tärkeintä, monifotonimikroskopia voi yhdistää useita kontrastipaloja rinnakkain ja ilman merkintöjä kudoksen eri elementtien tunnistamiseksi. Toisen harmonisen sukupolven (SHG) signaalit mahdollistavat värjäytymättömän fibrillaarisen kollageenin spesifisen kuvantamisen vertaansa vailla olevalla herkkyydellä, kun taas kahden fotonin viritetty fluoresenssi (2PEF) mahdollistaa solukuvauksen useiden sisäisten solukromoforien sekä elastiinikuvauksen ansiosta ihossa tai muissa kudoksissa (katso Kuva 1) (6).

Monifotonimikroskooppia on käytetty useissa ihotutkimuksissa, mukaan lukien LOB:ssa (katso kuva 1), jotka ovat osoittaneet tämän tekniikan suuren merkityksen ihokuitujen, erityisesti elastiini- ja kollageenikuitujen, rakenteellisen karakterisoinnin ja niiden mahdollisen muuttamisen kannalta. Sitä on sovellettu ihon ikääntymisen sekä elastisten (PXE) tai kollageenikuitujen (Marfanin oireyhtymän) rappeutumiseen johtavien patologioiden tutkimuksessa (7-9). Tämä tekniikka on siksi erittäin sopiva elastisten kuitujen rakenteen tutkimiseen ihon tulehdusilmiöiden ja kalkkeutuvien dermatoosien aikana.

Samanaikaisesti ihon tulehdusprosessia tutkitaan muilla menetelmillä. Immunohistokemiaa käytetään ihon MMP:n havaitsemiseen ja röntgenfluoresenssia (Synchrotron Soleil, Diffabs-linjalla) käytetään osoittamaan ihonsisäisiä sinkki- ja muita metallikerrostumia, kuten aiemmissa tutkimuksissamme tehtiin (kuva 2).

Kuva 2: Ihobiopsian röntgenfluoresenssi: esimerkki korrelaatiosta dermaalisen tulehduksellisen infiltraatin (A) ja ihonsisäisen sinkin (B) välillä, tässä tatuoinnin jäkäläreaktion aikana (kuvat tallennettu Soleil Synchrotron, Diffabs-linjalla, S. Reguer, D. Bazin ja H. Colboc).

Projektimme päätavoitteena on karakterisoida elastisten kuitujen rakenteellisia muutoksia kalkkiutuvan dermatoosin aikana.

Toissijaiset tavoitteet ovat:

• tutkia ihon tulehdusprosessien vaikutuksia elastisten kuitujen muuttumiseen,
• tunnistaa mahdolliset nukleaatiopesäkkeet fosfo-kalsiumkertymien muodostumista varten elastisten iho- ja verisuonikuitujen sisällä.

Ihonäytteet. Tutkimus suoritetaan pääasiassa ihmisen iholla, mutta myös PXE:n ABCC6 KO -hiiren hiirimallilla. Tarkemmin sanottuna LOB:ssa opiskeltava materiaali on:

• Ihmisen ihobiopsiat, jotka on jo kerätty näiden kalkkeutuvien dermatoosien diagnosointiin: PXE, kalsifylaksia, muut kalkkeutuvat tulehdukselliset dermatoosit (lupus panniculitis, dermatomyositis), Tenonin sairaalan patologialaboratoriosta (Dr Moguelet).
• Kontrollina ihmisen biopsiat terveestä ihosta eri-ikäisiltä potilailta (ihokasvaimen poiston marginaali), Tenonin sairaalasta. Keskitymme potilaisiin, joilla on pitkälle edennyt ihon ikääntyminen, erityisesti potilaisiin, joilla on aurinkoelastoos. Tämä UV-indusoitujen elastisten kuitujen muutosmalli on loistava hallinta ei-inflammatoristen ja kalkkiutumattomien elastisten kuitujen vaurioiden suhteen.
• Ihobiopsiat PXE:n hiirimallista (ABCC6 KO-hiiri) ja vastaavista kontrollihiiristä, INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokollat. Kaikki nämä biopsiat karakterisoidaan monifotonimikroskoopilla yhdistämällä 2PEF- ja SHG-kontrastit elastisten ja kollageenikuitujen kuvaamiseksi samanaikaisesti. Ensimmäisessä vaiheessa kokeellinen protokolla on seuraava:

• Tenonin sairaalassa tuotettiin useita sarjalaseja kustakin biopsiasta: 1 värjäämätön ("valkoinen") objektilasi monifotonikuvaukseen, 1 objektilasi tavallisella morfologisella värjäyksellä (hematoksyliini-eosiini-safran, HES), 1 objektilasi, jossa on värjäys, joka korostaa kalsiumkertymiä (Von Kossa) ) ja 3 objektilasia, joissa on tärkeimpien MMP:iden (vasta-aineet MMP-1:tä, 2:ta ja 9:tä vastaan) immunohistokemialliset leimat.
• kaikkien värjäytyneiden objektilasien kuvantaminen LOB:ssa tavallisella kirkaskenttäoptisella mikroskoopilla (standardi ja polarisoitu läpäisevä valo, fluoresenssi, DIC) suurella näkökentällä mosaiikkia käyttäen; tulehdusprosessia, kudosten uudelleenmuotoilua tai mineraaliesiintymiä vastaavien kiinnostavien alueiden (ROI) tunnistaminen. Huomaa, että mineraaliesiintymät paljastuvat polarisoidulla läpäisevällä valolla tai vaihekontrastilla tai DIC:llä.
• Röntgenfluoresenssikuvaus Soleil Synchrotronissa biopsioiden metallikerrostumien, erityisesti sinkin, tunnistamiseksi. Tämä tehdään yhteistyössä Dominique Bazinin kanssa (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), jolla on vahva asiantuntemus Diffabs-linjan mineraalikuvauksesta.
• Monivalokuvaus tunnistettujen kiinnostavien alueiden LOB:ssa tai jopa suurella näkökentällä ompelemalla automaattisesti useita laattoja. Polarisaatiolla erotettuja kuvia tehdään myös erittäin tiheillä alueilla tai uusituilla alueilla kollageeni- ja elastiinikuitujen suunnan kartoittamiseksi (10).
• Monifotonisten LOB-kuvien automaattinen kvantitatiivinen analyysi useiden elastiinin määrään ja rakenteeseen liittyvien parametrien mittaamiseksi. Automatisoidut kvantitatiiviset analyysit suoritetaan myös kollageenille ja muille kiinnostaville rakenteille, jotka havaitaan monifotonikuvissa tai histologisissa kuvissa. Eri kuvantamismenetelmien tulokset korreloidaan jokaisessa diasarjassa. Huomaa, että automaattinen analyysi on välttämätön sekä puolikvantitatiivisen analyysin tavanomaisten harhojen välttämiseksi että informatiivisempien rakenteellisten parametrien saamiseksi. Esimerkiksi elastiinikuvista poimitaan seuraavat parametrit: elastisten kuitujen keskimääräinen tiheys (per cm², papillaarisessa dermiksessä ja verkkonahassa), elastisten kuitujen orientaatiojakauma, entropia ja ympyrävarianssi tästä jakaumasta, elastisten kuitujen kaarevuusaste, niiden etäisyys mineraaliesiintymistä.
• Multimodaalisten tietojen tilastollinen analyysi, joka perustuu asianmukaisiin tilastollisiin testeihin. A priori ei-parametrisia testejä (Wilcoxon-Mann-Whitney) käytetään, koska käytettävissä on suhteellisen pieni määrä ihmisnäytteitä. Ryhmää kohden tutkitaan vähintään 8 potilasta, mikä pitäisi riittää automaattisten mittausten tarkkuuden ja toistettavuuden vuoksi. Jos samalle potilaalle suoritetaan useita näytteitä tai kuvasarjoja, käytetään sisäkkäisiä tilastollisia testejä (sisätetty t-testi tai sisäkkäinen Wilcoxon).

Toisessa vaiheessa ja ensimmäisen vaiheen tulosten perusteella tämän protokollan useita kohtia parannetaan, jotta saadaan lisää tietoa:

• Multifotonikuvaus suoritetaan ehjästä hiiren ihon biopsioista elastiinin 3D-organisaation korostamiseksi paremmin.
• Tulehduksen kehittynyt fluoresenssikuvaus suoritetaan hiiren iholla ex vivo käyttämällä spektri- tai FLIM-mittauksia (fluoresenssi lifetime imaging microscopy)

• Kolmannen harmonisen sukupolven (THG) avulla havainnollistetaan mineraaliesiintymien rakenne.

  1. Bazin D, et ai. Patologisten mikrokalsifikaatioiden karakterisointi ja joitain fysikaalis-kemiallisia näkökohtia. Chem Rev. 10. lokakuuta 2012; 112(10):5092-120.

Erilaisia ​​patologioita, joihin liittyy mineraaliesiintymiä kudoksissa, on suuri (syövät, tartuntaprosessit, ympäristötaudit) (1). Dermatologiassa kalsiummineraalikertymiin liittyy useita patologioita, kuten kalsifylaksia ja pseudoxanthoma elasticum (PXE). Tähän mennessä on tehty vain vähän tutkimuksia ihon mineraaliesiintymien kemiallisista ominaisuuksista, niiden fysiopatologisista seurauksista, niihin liittyvien sairauksien esiintymisestä ja niiden vaikutuksista ihmiselimiin.

Tämä on motivoinut Hester COLBOC, M.D.:n tohtoriprojektia kalsiumkertymien karakterisoimiseksi erilaisissa kalkkeutuvissa dermatooseissa, mukaan lukien kalsifylaksia (2) ja sarkoidoosi (3). Tämä perustutkimusprojekti toteutetaan LCP:n (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) ja AP-HP:n yhteistyönä erityisesti uronefrologian (virtsan litiaasi) ja onkologian aloilla. (4) (kalkkeutumat rinta- ja kilpirauhassyövässä). Olemme osoittaneet, että ihon kalkkeutumat koostuvat karbapatiitista kalsifylaksissa ja kalsiitista sarkoidoosissa. Olemme myös osoittaneet, että nämä kerrostumat sijaitsevat pääasiassa ihon tai suonen seinämän elastisissa kuiduissa, mikä viittaa siihen, että näissä kuiduissa on tutkittava molekyylin nukleaatioreitti.

Tämä rakenteellinen ja kemiallinen kuvaus on innovatiivinen, mutta ei vastaa kaikkiin näihin kalsiumkertymiin liittyviin kysymyksiin: miksi joillakin potilailla, joilla on normaali fosfokalsiumtasapaino, on massiivisia kalkkeutumia ihossa? Miksi päinvastoin muilla potilailla, kuten joillakin dialyysipotilailla, on erittäin häiriintynyt fosfokalkkitasapaino, mutta ei ihon kalkkeutumista? Tämä paradoksi nostaa esiin mahdollisuuden "ydinpesäkkeiden" olemassaoloon elastisissa iho- ja verisuonikuiduissa, mikä suosii fosfokalkkikerrostumien saostumista joillakin potilailla. Jotkut in vitro -mallit ovat tutkineet näitä nukleaatiokeskuksia elastisten kuitujen sisällä. (viite Gourgas et al) On huomattavaa, että useimpia kalkkeutuvia ihottumia edeltää ihon tulehdustila. Nämä ihon tulehdusilmiöt voivat myös aiheuttaa kalsiumkertymien saostumista. Jotkut kirjoittajat spekuloivat siten, että metalloproteinaasi (MMP) pilkkoo elastiinia solunulkoisessa matriisissa, mikä luo nukleaatiopesäkkeitä, jotka suosivat fosfokalkkikertymiä. Munavalli et ai. osoitti kohonneen MMP-tason kalsifylaksiaa sairastavan potilaan virtsanäytteessä nopean painonpudotuksen yhteydessä (5). He olettavat, että kohonneet seerumin MMP-tasot tällä potilaalla voivat johtaa ulkoisen elastisuusrajan muutokseen ja verisuonten kalkkeutumiseen. Tätä hypoteesia tukevat toisaalta muut elastisten kuitujen muutosmallit, kuten ihon ikääntymisen aikana (dermatoporoosi), joissa ei ole tulehdusta eikä kalkkeutumista.

Projektimme taustaolettamuksena on, että ihotulehdus johtaa elastisten säikeiden spesifiseen muutokseen, mikä edistää niiden kalkkeutumista.

Tämän hypoteesin tutkimiseksi, erityisesti kalsifylaksian ja PXE:n aikana, ehdotamme monifotonimikroskoopin käyttöä, kuvantamistekniikkaa, joka on saatavilla Ecole Polytechniquen Laboratoire d'Optique et Biosciencesissa (LOB). Monifotomikroskopia on kehitetty 1990-luvun alussa vaihtoehtona konfokaalimikroskopialle parantamaan biologisten kudosten syvällistä kuvantamista submikrometrisellä resoluutiolla. Mikä tärkeintä, monifotonimikroskopia voi yhdistää useita kontrastipaloja rinnakkain ja ilman merkintöjä kudoksen eri elementtien tunnistamiseksi. Toisen harmonisen sukupolven (SHG) signaalit mahdollistavat värjäytymättömän fibrillaarisen kollageenin spesifisen kuvantamisen vertaansa vailla olevalla herkkyydellä, kun taas kahden fotonin viritetty fluoresenssi (2PEF) mahdollistaa solukuvauksen useiden sisäisten solukromoforien sekä elastiinikuvauksen ansiosta ihossa tai muissa kudoksissa (katso Kuva 1) (6).

Monifotonimikroskooppia on käytetty useissa ihotutkimuksissa, mukaan lukien LOB:ssa (katso kuva 1), jotka ovat osoittaneet tämän tekniikan suuren merkityksen ihokuitujen, erityisesti elastiini- ja kollageenikuitujen, rakenteellisen karakterisoinnin ja niiden mahdollisen muuttamisen kannalta. Sitä on sovellettu ihon ikääntymisen sekä elastisten (PXE) tai kollageenikuitujen (Marfanin oireyhtymän) rappeutumiseen johtavien patologioiden tutkimuksessa (7-9). Tämä tekniikka on siksi erittäin sopiva elastisten kuitujen rakenteen tutkimiseen ihon tulehdusilmiöiden ja kalkkeutuvien dermatoosien aikana.

Samanaikaisesti ihon tulehdusprosessia tutkitaan muilla menetelmillä. Immunohistokemiaa käytetään ihon MMP:n havaitsemiseen ja röntgenfluoresenssia (Synchrotron Soleil, Diffabs-linjalla) käytetään osoittamaan ihonsisäisiä sinkki- ja muita metallikerrostumia, kuten aiemmissa tutkimuksissamme tehtiin (kuva 2).

Kuva 2: Ihobiopsian röntgenfluoresenssi: esimerkki korrelaatiosta dermaalisen tulehduksellisen infiltraatin (A) ja ihonsisäisen sinkin (B) välillä, tässä tatuoinnin jäkäläreaktion aikana (kuvat tallennettu Soleil Synchrotron, Diffabs-linjalla, S. Reguer, D. Bazin ja H. Colboc).

Projektimme päätavoitteena on karakterisoida elastisten kuitujen rakenteellisia muutoksia kalkkiutuvan dermatoosin aikana.

Toissijaiset tavoitteet ovat:

• tutkia ihon tulehdusprosessien vaikutuksia elastisten kuitujen muuttumiseen,
• tunnistaa mahdolliset nukleaatiopesäkkeet fosfo-kalsiumkertymien muodostumista varten elastisten iho- ja verisuonikuitujen sisällä.

Ihonäytteet. Tutkimus suoritetaan pääasiassa ihmisen iholla, mutta myös PXE:n ABCC6 KO -hiiren hiirimallilla. Tarkemmin sanottuna LOB:ssa opiskeltava materiaali on:

• Ihmisen ihobiopsiat, jotka on jo kerätty näiden kalkkeutuvien dermatoosien diagnosointiin: PXE, kalsifylaksia, muut kalkkeutuvat tulehdukselliset dermatoosit (lupus panniculitis, dermatomyositis), Tenonin sairaalan patologialaboratoriosta (Dr Moguelet).
• Kontrollina ihmisen biopsiat terveestä ihosta eri-ikäisiltä potilailta (ihokasvaimen poiston marginaali), Tenonin sairaalasta. Keskitymme potilaisiin, joilla on pitkälle edennyt ihon ikääntyminen, erityisesti potilaisiin, joilla on aurinkoelastoos. Tämä UV-indusoitujen elastisten kuitujen muutosmalli on loistava hallinta ei-inflammatoristen ja kalkkiutumattomien elastisten kuitujen vaurioiden suhteen.
• Ihobiopsiat PXE:n hiirimallista (ABCC6 KO-hiiri) ja vastaavista kontrollihiiristä, INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokollat. Kaikki nämä biopsiat karakterisoidaan monifotonimikroskoopilla yhdistämällä 2PEF- ja SHG-kontrastit elastisten ja kollageenikuitujen kuvaamiseksi samanaikaisesti. Ensimmäisessä vaiheessa kokeellinen protokolla on seuraava:

• Tenonin sairaalassa tuotettiin useita sarjalaseja kustakin biopsiasta: 1 värjäämätön ("valkoinen") objektilasi monifotonikuvaukseen, 1 objektilasi tavallisella morfologisella värjäyksellä (hematoksyliini-eosiini-safran, HES), 1 objektilasi, jossa on värjäys, joka korostaa kalsiumkertymiä (Von Kossa) ) ja 3 objektilasia, joissa on tärkeimpien MMP:iden (vasta-aineet MMP-1:tä, 2:ta ja 9:tä vastaan) immunohistokemialliset leimat.
• kaikkien värjäytyneiden objektilasien kuvantaminen LOB:ssa tavallisella kirkaskenttäoptisella mikroskoopilla (standardi ja polarisoitu läpäisevä valo, fluoresenssi, DIC) suurella näkökentällä mosaiikkia käyttäen; tulehdusprosessia, kudosten uudelleenmuotoilua tai mineraaliesiintymiä vastaavien kiinnostavien alueiden (ROI) tunnistaminen. Huomaa, että mineraaliesiintymät paljastuvat polarisoidulla läpäisevällä valolla tai vaihekontrastilla tai DIC:llä.
• Röntgenfluoresenssikuvaus Soleil Synchrotronissa biopsioiden metallikerrostumien, erityisesti sinkin, tunnistamiseksi. Tämä tehdään yhteistyössä Dominique Bazinin kanssa (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), jolla on vahva asiantuntemus Diffabs-linjan mineraalikuvauksesta.
• Monivalokuvaus tunnistettujen kiinnostavien alueiden LOB:ssa tai jopa suurella näkökentällä ompelemalla automaattisesti useita laattoja. Polarisaatiolla erotettuja kuvia tehdään myös erittäin tiheillä alueilla tai uusituilla alueilla kollageeni- ja elastiinikuitujen suunnan kartoittamiseksi (10).
• Monifotonisten LOB-kuvien automaattinen kvantitatiivinen analyysi useiden elastiinin määrään ja rakenteeseen liittyvien parametrien mittaamiseksi. Automatisoidut kvantitatiiviset analyysit suoritetaan myös kollageenille ja muille kiinnostaville rakenteille, jotka havaitaan monifotonikuvissa tai histologisissa kuvissa. Eri kuvantamismenetelmien tulokset korreloidaan jokaisessa diasarjassa. Huomaa, että automaattinen analyysi on välttämätön sekä puolikvantitatiivisen analyysin tavanomaisten harhojen välttämiseksi että informatiivisempien rakenteellisten parametrien saamiseksi. Esimerkiksi elastiinikuvista poimitaan seuraavat parametrit: elastisten kuitujen keskimääräinen tiheys (per cm², papillaarisessa dermiksessä ja verkkonahassa), elastisten kuitujen orientaatiojakauma, entropia ja ympyrävarianssi tästä jakaumasta, elastisten kuitujen kaarevuusaste, niiden etäisyys mineraaliesiintymistä.
• Multimodaalisten tietojen tilastollinen analyysi, joka perustuu asianmukaisiin tilastollisiin testeihin. A priori ei-parametrisia testejä (Wilcoxon-Mann-Whitney) käytetään, koska käytettävissä on suhteellisen pieni määrä ihmisnäytteitä. Ryhmää kohden tutkitaan vähintään 8 potilasta, mikä pitäisi riittää automaattisten mittausten tarkkuuden ja toistettavuuden vuoksi. Jos samalle potilaalle suoritetaan useita näytteitä tai kuvasarjoja, käytetään sisäkkäisiä tilastollisia testejä (sisätetty t-testi tai sisäkkäinen Wilcoxon).

Toisessa vaiheessa ja ensimmäisen vaiheen tulosten perusteella tämän protokollan useita kohtia parannetaan, jotta saadaan lisää tietoa:

• Multifotonikuvaus suoritetaan ehjästä hiiren ihon biopsioista elastiinin 3D-organisaation korostamiseksi paremmin.
• Tulehduksen kehittynyt fluoresenssikuvaus suoritetaan hiiren iholla ex vivo käyttämällä spektri- tai FLIM-mittauksia (fluoresenssi lifetime imaging microscopy)

• Kolmannen harmonisen sukupolven (THG) avulla havainnollistetaan mineraaliesiintymien rakenne.

  1. Bazin D, et ai. Patologisten mikrokalsifikaatioiden karakterisointi ja joitain fysikaalis-kemiallisia näkökohtia. Chem Rev. 10. lokakuuta 2012; 112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et ai. Kalsifylaksiaan liittyvien ihokerrostumien sijainti, morfologiset ominaisuudet ja kemiallinen koostumus potilailla, joilla on kalkkiureeminen arteriolopatia. JAMA Dermatology 2019.
  3. H Colboc, et ai. Granuloomiin liittyvien epäorgaanisten kerrostumien fysikaalis-kemiallinen karakterisointi ihon sarkoidoosissa. European Academy of Dermatology and Venereology -lehti 2018.
  4. Haka AS, et ai. Mikrokalsifikaatioiden tunnistaminen hyvän- ja pahanlaatuisissa rintavaurioissa tutkimalla eroja niiden kemiallisessa koostumuksessa Raman-spektroskopian avulla. Cancer Res. 15. syyskuuta 2002; 62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et ai. Painonpudotuksen aiheuttama kalsifylaksia: matriksin metalloproteinaasien mahdollinen rooli. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthetiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmetiques." Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et ai. "Ikäperäiset morfologiset muutokset ihon matriisissa ihmisen ihossa dokumentoitu in vivo monifotonimikroskoopilla." Journal of Biomedical Optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et ai. "Aortan ja ihon elastiinin ja kollageenin morfologian kvantifiointi Marfanin oireyhtymässä monifotonimikroskoopilla." Journal of rakennebiologia 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P. L. et ai. "Kvantitatiivinen lähestymistapa elastiiniin liittyvien sairauksien histopatologiseen dissektioon monifotonimikroskoopilla." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire ja M.-C. Schanne-Klein, "Dynaamisen kollageenin uudelleenjärjestelyn seuranta ihon venytyksen aikana nopealla polarisaatiolla erotetulla SHG-kuvauksella." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).