Zmiana włókien elastycznych skóry podczas zwapniającej dermatozy: badanie strukturalne przy użyciu mikroskopii wielofotonowej (Calciphoton)

Różnorodność patologii, którym towarzyszą złogi mineralne w tkankach jest duża (nowotwory, procesy zakaźne, choroby środowiskowe) (1). W dermatologii kilka patologii jest związanych z odkładaniem się minerałów wapnia, takich jak kalcyfilaksja i pseudoxanthoma elasticum (PXE). Do tej pory przeprowadzono niewiele badań dotyczących chemicznej charakterystyki złogów mineralnych skóry, ich skutków fizjopatologicznych, występowania towarzyszących patologii i ich wpływu na narządy ludzkie.

To zmotywowało projekt doktorancki dr Hester COLBOC dotyczący charakterystyki złogów wapnia w różnych zwapniających dermatozach, w tym wapnieniu (2) i sarkoidozie (3). Ten fundamentalny projekt badawczy jest realizowany w ramach współpracy między LCP (Instytut Fizyko-Chemii, CNRS, Uniwersytet Paris-Saclay) i AP-HP, w szczególności w dziedzinie uronefrologii (kamica moczowa) i onkologii (4) (zwapnienia w raku piersi i tarczycy). Wykazaliśmy, że zwapnienia skóry składają się z karbapatytu w kalcyfilaksji i kalcytu w sarkoidozie. Wykazaliśmy również, że osady te znajdują się głównie we włóknach elastycznych skóry właściwej lub ściany naczynia, co sugeruje zbadanie szlaku zarodkowania molekularnego w tych włóknach.

Ten strukturalny i chemiczny opis jest innowacyjny, ale nie odpowiada na wszystkie pytania, które pojawiają się wokół tych złogów wapnia: dlaczego u niektórych pacjentów, którzy wykazują prawidłową równowagę fosforanowo-wapniową, występują masywne zwapnienia skóry? Dlaczego, wręcz przeciwnie, inni pacjenci, na przykład niektórzy pacjenci dializowani, wykazują skrajnie zaburzone bilanse fosforanowo-wapniowe, ale bez zwapnień skóry? Ten paradoks stwarza możliwość istnienia „ognisk zarodkowania” w obrębie elastycznych włókien skórnych i naczyniowych, sprzyjających wytrącaniu się złogów fosfwapniowych u niektórych pacjentów. Niektóre modele in vitro badały te ogniska zarodkowania we włóknach elastycznych. (ref Gourgas i wsp.) Co ciekawe, większość zwapniających dermatoz poprzedza skórny stan zapalny. Te zjawiska zapalne skóry mogą również powodować wytrącanie się złogów wapnia. Niektórzy autorzy spekulują zatem, że elastyna jest trawiona przez metaloproteinazę (MMP) w macierzy pozakomórkowej, tworząc w ten sposób ogniska zarodkowania sprzyjające złogom fosfokapniowym. Munavalli i in. wykazali wzrost poziomu MMP w próbce moczu pacjenta z kalcyfilaksją w kontekście szybkiej utraty masy ciała (5). Wysuwają hipotezę, że podwyższone poziomy MMP w surowicy u tego pacjenta mogą prowadzić do zmiany zewnętrznej granicy sprężystości i zwapnień naczyniowych. Hipotezę tę potwierdzają natomiast inne modele przemian włókien elastycznych, np. podczas starzenia się skóry (dermatoporoza), w których nie występuje stan zapalny ani zwapnienia.

Podstawową hipotezą naszego projektu jest to, że zapalenie skóry prowadzi do specyficznej zmiany włókien elastycznych, co sprzyja ich zwapnieniu.

Aby zbadać tę hipotezę, szczególnie podczas kalcyfilaksji i PXE, proponujemy zastosowanie mikroskopii wielofotonowej, techniki obrazowania dostępnej w Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) w Ecole Polytechnique. Mikroskopia wielofotonowa została opracowana na początku lat 90. XX wieku jako alternatywa dla mikroskopii konfokalnej w celu poprawy dogłębnego obrazowania tkanek biologicznych z rozdzielczością submikrometryczną. Co najważniejsze, mikroskopia wielofotonowa może łączyć kilka warstw kontrastu równolegle i bez żadnego znakowania w celu identyfikacji różnych elementów tkanki. Sygnały generacji drugiej harmonicznej (SHG) umożliwiają specyficzne obrazowanie niebarwionego kolagenu włóknistego z niezrównaną czułością, podczas gdy fluorescencja wzbudzona dwoma fotonami (2PEF) umożliwia obrazowanie komórek dzięki różnym wewnętrznym chromoforom komórkowym, jak również obrazowaniu elastyny ​​w skórze właściwej lub w innych tkankach (zob. Rysunek 1) (6).

Mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana w kilku badaniach skóry, w tym w LOB (patrz ryc. 1), które udowodniły duże znaczenie tej techniki dla charakterystyki strukturalnej włókien skórnych, zwłaszcza włókien elastyny ​​i kolagenu, oraz ich możliwych zmian. Znalazła zastosowanie w badaniu procesu starzenia się skóry, a także patologii prowadzących do degeneracji włókien elastycznych (PXE) lub kolagenowych (zespół Marfana) (7-9). Technika ta jest zatem wysoce odpowiednia do badania struktury włókien elastycznych podczas skórnych zjawisk zapalnych i zwapniających dermatoz.

Równolegle proces zapalny skóry będzie badany innymi metodami. Immuno-histochemia zostanie wykorzystana do wykrycia MMP w skórze, a fluorescencja rentgenowska (w Synchrotron Soleil, linia Diffabs) zostanie wykorzystana do wykazania śródskórnego cynku i innych osadów metalicznych, jak to zrobiono w naszych poprzednich badaniach (ryc. 2).

Rycina 2: Fluorescencja rentgenowska biopsji skóry: przykład korelacji między naciekiem zapalnym skóry (A) a obecnością śródskórnego cynku (B), tutaj podczas reakcji liszajowatej na tatuażu (zdjęcia zarejestrowane w Soleil Synchrotron, linia Diffabs, S. Reguera, D. Bazina i H. Colboca).

Głównym celem naszego projektu jest scharakteryzowanie zmian strukturalnych włókien elastycznych podczas dermatozy zwapniającej.

Cele drugorzędne to:

• badanie wpływu skórnych procesów zapalnych na przemianę włókien elastycznych,
• zidentyfikować możliwe ogniska zarodkowania dla tworzenia się złogów fosfo-wapniowych w elastycznych włóknach skórnych i naczyniowych.

Próbki skóry. Badanie zostanie przeprowadzone głównie na ludzkiej skórze, ale także na mysim modelu PXE: mysz ABCC6 KO. Dokładniej, materiałem badanym w LOB będzie:

• Biopsje ludzkiej skóry już pobrane do diagnozy tych zwapniających dermatoz: PXE, kalcyfilaksja, inne zwapniające zapalne dermatozy (zapalenie tkanki podskórnej tocznia, zapalenie skórno-mięśniowe), z laboratorium patologii szpitala Tenon (dr Moguelet).
• Jako kontrole zastosowano ludzkie biopsje zdrowej skóry od pacjentów w różnym wieku (margines usunięcia guza skóry) ze szpitala Tenon. Skupimy się na pacjentach z zaawansowanym procesem starzenia się skóry, aw szczególności na pacjentach z elastozą słoneczną. Ten model zmian włókien elastycznych indukowanych promieniowaniem UV jest doskonałą kontrolą w zakresie niezapalnych i niezwapniałych uszkodzeń włókien elastycznych.
• Biopsje skórne z mysiego modelu PXE (mysz ABCC6 KO) i od dopasowanych myszy kontrolnych z INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoły. Wszystkie te biopsje zostaną scharakteryzowane za pomocą mikroskopii wielofotonowej poprzez połączenie kontrastów 2PEF i SHG w celu jednoczesnego obrazowania włókien elastycznych i kolagenowych. W pierwszym etapie protokół eksperymentalny będzie wyglądał następująco:

• Produkcja w Tenon Hospital kilku seryjnych preparatów z każdej biopsji: 1 niebarwiony („biały”) preparat do obrazowania wielofotonowego, 1 preparat ze zwykłym barwieniem morfologicznym (hematoksylina-eozyna-safran, HES), 1 preparat z barwieniem podkreślającym złogi wapnia (Von Kossa ) i 3 szkiełka ze znakowaniem immunohistochemicznym głównych MMP (przeciwciała przeciwko MMP-1, 2 i 9).
• obrazowanie w LOB na standardowym mikroskopie optycznym jasnego pola (standardowe i spolaryzowane światło przechodzące, fluorescencja, DIC) wszystkich wybarwionych szkiełek w dużym polu widzenia przez mozaikowanie; identyfikacja obszarów zainteresowania (ROI) odpowiadających procesom zapalnym, przebudowie tkanek lub złogom mineralnym. Należy zauważyć, że osady mineralne są ujawniane przez spolaryzowane światło przechodzące lub kontrast fazowy lub DIC.
• Obrazowanie fluorescencji rentgenowskiej w Soleil Synchrotron w celu identyfikacji osadów metalicznych obecnych w biopsjach, zwłaszcza cynku. Odbędzie się to we współpracy z Dominique Bazin (Instytut Fizyko-Chemii, CNRS, Uniwersytet Paris-Saclay), który ma duże doświadczenie w obrazowaniu minerałów w linii Diffabs.
• Obrazowanie wielofotonowe w LOB zidentyfikowanych obszarów zainteresowania, a nawet na dużym polu widzenia poprzez automatyczne łączenie kilku płytek. Obrazy z rozdzielczością polaryzacyjną będą również wykonywane w obszarach bardzo gęstych lub w obszarach przebudowanych w celu odwzorowania kierunku włókien kolagenu i elastyny ​​(10).
• Zautomatyzowana analiza ilościowa wielofotonowych obrazów LOB w celu pomiaru kilku parametrów związanych z ilością i strukturą elastyny. Zautomatyzowane analizy ilościowe zostaną również przeprowadzone na kolagenie i innych interesujących strukturach obserwowanych na obrazach wielofotonowych lub obrazach histologicznych. Wyniki różnych metod obrazowania zostaną skorelowane na każdej serii slajdów. Należy zauważyć, że analiza automatyczna jest niezbędna zarówno do uniknięcia typowych błędów analizy półilościowej, jak i do uzyskania bardziej informacyjnych parametrów strukturalnych. Na przykład następujące parametry zostaną wyodrębnione z obrazów elastyny: średnia gęstość włókien elastycznych (na cm², w skórze brodawkowatej i siateczkowatej), rozkład orientacji włókien elastycznych, entropia i wariancja kołowa tego rozkładu, stopień krzywizny włókien elastycznych, ich odległość od złóż mineralnych.
• Analiza statystyczna danych multimodalnych w oparciu o odpowiednie testy statystyczne. Ze względu na stosunkowo niewielką liczbę dostępnych próbek ludzkich zostaną zastosowane a priori testy nieparametryczne (Wilcoxon-Mann-Whitney). Przebadanych zostanie co najmniej 8 pacjentów na grupę, co powinno wystarczyć ze względu na dokładność i powtarzalność zautomatyzowanych pomiarów. Jeśli u tego samego pacjenta wykonano kilka próbek lub serii obrazów, zostaną użyte zagnieżdżone testy statystyczne (zagnieżdżone testy t lub zagnieżdżone testy Wilcoxona).

W drugim kroku iw oparciu o wyniki pierwszego kroku różne elementy tego protokołu zostaną ulepszone, aby uzyskać dostęp do większej ilości informacji:

• Obrazowanie wielofotonowe zostanie wykonane w biopsjach nienaruszonej skóry mysiej, aby lepiej uwypuklić trójwymiarową organizację elastyny.
• Zaawansowane obrazowanie fluorescencyjne stanu zapalnego zostanie przeprowadzone na mysiej skórze ex vivo, przy użyciu pomiarów spektralnych lub FLIM (mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji)

• Do wizualizacji struktury złóż mineralnych zostanie wykorzystana generacja trzeciej harmonicznej (THG).

  1. Bazin D i in. Charakterystyka i niektóre aspekty fizykochemiczne patologicznych mikrozwapnień. Chem Rev. 10 października 2012;112(10):5092-120.

Różnorodność patologii, którym towarzyszą złogi mineralne w tkankach jest duża (nowotwory, procesy zakaźne, choroby środowiskowe) (1). W dermatologii kilka patologii jest związanych z odkładaniem się minerałów wapnia, takich jak kalcyfilaksja i pseudoxanthoma elasticum (PXE). Do tej pory przeprowadzono niewiele badań dotyczących chemicznej charakterystyki złogów mineralnych skóry, ich skutków fizjopatologicznych, występowania towarzyszących patologii i ich wpływu na narządy ludzkie.

To zmotywowało projekt doktorancki dr Hester COLBOC dotyczący charakterystyki złogów wapnia w różnych zwapniających dermatozach, w tym wapnieniu (2) i sarkoidozie (3). Ten fundamentalny projekt badawczy jest realizowany w ramach współpracy między LCP (Instytut Fizyko-Chemii, CNRS, Uniwersytet Paris-Saclay) i AP-HP, w szczególności w dziedzinie uronefrologii (kamica moczowa) i onkologii (4) (zwapnienia w raku piersi i tarczycy). Wykazaliśmy, że zwapnienia skóry składają się z karbapatytu w kalcyfilaksji i kalcytu w sarkoidozie. Wykazaliśmy również, że osady te znajdują się głównie we włóknach elastycznych skóry właściwej lub ściany naczynia, co sugeruje zbadanie szlaku zarodkowania molekularnego w tych włóknach.

Ten strukturalny i chemiczny opis jest innowacyjny, ale nie odpowiada na wszystkie pytania, które pojawiają się wokół tych złogów wapnia: dlaczego u niektórych pacjentów, którzy wykazują prawidłową równowagę fosforanowo-wapniową, występują masywne zwapnienia skóry? Dlaczego, wręcz przeciwnie, inni pacjenci, na przykład niektórzy pacjenci dializowani, wykazują skrajnie zaburzone bilanse fosforanowo-wapniowe, ale bez zwapnień skóry? Ten paradoks stwarza możliwość istnienia „ognisk zarodkowania” w obrębie elastycznych włókien skórnych i naczyniowych, sprzyjających wytrącaniu się złogów fosfwapniowych u niektórych pacjentów. Niektóre modele in vitro badały te ogniska zarodkowania we włóknach elastycznych. (ref Gourgas i wsp.) Co ciekawe, większość zwapniających dermatoz poprzedza skórny stan zapalny. Te zjawiska zapalne skóry mogą również powodować wytrącanie się złogów wapnia. Niektórzy autorzy spekulują zatem, że elastyna jest trawiona przez metaloproteinazę (MMP) w macierzy pozakomórkowej, tworząc w ten sposób ogniska zarodkowania sprzyjające złogom fosfokapniowym. Munavalli i in. wykazali wzrost poziomu MMP w próbce moczu pacjenta z kalcyfilaksją w kontekście szybkiej utraty masy ciała (5). Wysuwają hipotezę, że podwyższone poziomy MMP w surowicy u tego pacjenta mogą prowadzić do zmiany zewnętrznej granicy sprężystości i zwapnień naczyniowych. Hipotezę tę potwierdzają natomiast inne modele przemian włókien elastycznych, np. podczas starzenia się skóry (dermatoporoza), w których nie występuje stan zapalny ani zwapnienia.

Podstawową hipotezą naszego projektu jest to, że zapalenie skóry prowadzi do specyficznej zmiany włókien elastycznych, co sprzyja ich zwapnieniu.

Aby zbadać tę hipotezę, szczególnie podczas kalcyfilaksji i PXE, proponujemy zastosowanie mikroskopii wielofotonowej, techniki obrazowania dostępnej w Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) w Ecole Polytechnique. Mikroskopia wielofotonowa została opracowana na początku lat 90. XX wieku jako alternatywa dla mikroskopii konfokalnej w celu poprawy dogłębnego obrazowania tkanek biologicznych z rozdzielczością submikrometryczną. Co najważniejsze, mikroskopia wielofotonowa może łączyć kilka warstw kontrastu równolegle i bez żadnego znakowania w celu identyfikacji różnych elementów tkanki. Sygnały generacji drugiej harmonicznej (SHG) umożliwiają specyficzne obrazowanie niebarwionego kolagenu włóknistego z niezrównaną czułością, podczas gdy fluorescencja wzbudzona dwoma fotonami (2PEF) umożliwia obrazowanie komórek dzięki różnym wewnętrznym chromoforom komórkowym, jak również obrazowaniu elastyny ​​w skórze właściwej lub w innych tkankach (zob. Rysunek 1) (6).

Mikroskopia wielofotonowa została wykorzystana w kilku badaniach skóry, w tym w LOB (patrz ryc. 1), które udowodniły duże znaczenie tej techniki dla charakterystyki strukturalnej włókien skórnych, zwłaszcza włókien elastyny ​​i kolagenu, oraz ich możliwych zmian. Znalazła zastosowanie w badaniu procesu starzenia się skóry, a także patologii prowadzących do degeneracji włókien elastycznych (PXE) lub kolagenowych (zespół Marfana) (7-9). Technika ta jest zatem wysoce odpowiednia do badania struktury włókien elastycznych podczas skórnych zjawisk zapalnych i zwapniających dermatoz.

Równolegle proces zapalny skóry będzie badany innymi metodami. Immuno-histochemia zostanie wykorzystana do wykrycia MMP w skórze, a fluorescencja rentgenowska (w Synchrotron Soleil, linia Diffabs) zostanie wykorzystana do wykazania śródskórnego cynku i innych osadów metalicznych, jak to zrobiono w naszych poprzednich badaniach (ryc. 2).

Rycina 2: Fluorescencja rentgenowska biopsji skóry: przykład korelacji między naciekiem zapalnym skóry (A) a obecnością śródskórnego cynku (B), tutaj podczas reakcji liszajowatej na tatuażu (zdjęcia zarejestrowane w Soleil Synchrotron, linia Diffabs, S. Reguera, D. Bazina i H. Colboca).

Głównym celem naszego projektu jest scharakteryzowanie zmian strukturalnych włókien elastycznych podczas dermatozy zwapniającej.

Cele drugorzędne to:

• badanie wpływu skórnych procesów zapalnych na przemianę włókien elastycznych,
• zidentyfikować możliwe ogniska zarodkowania dla tworzenia się złogów fosfo-wapniowych w elastycznych włóknach skórnych i naczyniowych.

Próbki skóry. Badanie zostanie przeprowadzone głównie na ludzkiej skórze, ale także na mysim modelu PXE: mysz ABCC6 KO. Dokładniej, materiałem badanym w LOB będzie:

• Biopsje ludzkiej skóry już pobrane do diagnozy tych zwapniających dermatoz: PXE, kalcyfilaksja, inne zwapniające zapalne dermatozy (zapalenie tkanki podskórnej tocznia, zapalenie skórno-mięśniowe), z laboratorium patologii szpitala Tenon (dr Moguelet).
• Jako kontrole zastosowano ludzkie biopsje zdrowej skóry od pacjentów w różnym wieku (margines usunięcia guza skóry) ze szpitala Tenon. Skupimy się na pacjentach z zaawansowanym procesem starzenia się skóry, aw szczególności na pacjentach z elastozą słoneczną. Ten model zmian włókien elastycznych indukowanych promieniowaniem UV jest doskonałą kontrolą w zakresie niezapalnych i niezwapniałych uszkodzeń włókien elastycznych.
• Biopsje skórne z mysiego modelu PXE (mysz ABCC6 KO) i od dopasowanych myszy kontrolnych z INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoły. Wszystkie te biopsje zostaną scharakteryzowane za pomocą mikroskopii wielofotonowej poprzez połączenie kontrastów 2PEF i SHG w celu jednoczesnego obrazowania włókien elastycznych i kolagenowych. W pierwszym etapie protokół eksperymentalny będzie wyglądał następująco:

• Produkcja w Tenon Hospital kilku seryjnych preparatów z każdej biopsji: 1 niebarwiony („biały”) preparat do obrazowania wielofotonowego, 1 preparat ze zwykłym barwieniem morfologicznym (hematoksylina-eozyna-safran, HES), 1 preparat z barwieniem podkreślającym złogi wapnia (Von Kossa ) i 3 szkiełka ze znakowaniem immunohistochemicznym głównych MMP (przeciwciała przeciwko MMP-1, 2 i 9).
• obrazowanie w LOB na standardowym mikroskopie optycznym jasnego pola (standardowe i spolaryzowane światło przechodzące, fluorescencja, DIC) wszystkich wybarwionych szkiełek w dużym polu widzenia przez mozaikowanie; identyfikacja obszarów zainteresowania (ROI) odpowiadających procesom zapalnym, przebudowie tkanek lub złogom mineralnym. Należy zauważyć, że osady mineralne są ujawniane przez spolaryzowane światło przechodzące lub kontrast fazowy lub DIC.
• Obrazowanie fluorescencji rentgenowskiej w Soleil Synchrotron w celu identyfikacji osadów metalicznych obecnych w biopsjach, zwłaszcza cynku. Odbędzie się to we współpracy z Dominique Bazin (Instytut Fizyko-Chemii, CNRS, Uniwersytet Paris-Saclay), który ma duże doświadczenie w obrazowaniu minerałów w linii Diffabs.
• Obrazowanie wielofotonowe w LOB zidentyfikowanych obszarów zainteresowania, a nawet na dużym polu widzenia poprzez automatyczne łączenie kilku płytek. Obrazy z rozdzielczością polaryzacyjną będą również wykonywane w obszarach bardzo gęstych lub w obszarach przebudowanych w celu odwzorowania kierunku włókien kolagenu i elastyny ​​(10).
• Zautomatyzowana analiza ilościowa wielofotonowych obrazów LOB w celu pomiaru kilku parametrów związanych z ilością i strukturą elastyny. Zautomatyzowane analizy ilościowe zostaną również przeprowadzone na kolagenie i innych interesujących strukturach obserwowanych na obrazach wielofotonowych lub obrazach histologicznych. Wyniki różnych metod obrazowania zostaną skorelowane na każdej serii slajdów. Należy zauważyć, że analiza automatyczna jest niezbędna zarówno do uniknięcia typowych błędów analizy półilościowej, jak i do uzyskania bardziej informacyjnych parametrów strukturalnych. Na przykład następujące parametry zostaną wyodrębnione z obrazów elastyny: średnia gęstość włókien elastycznych (na cm², w skórze brodawkowatej i siateczkowatej), rozkład orientacji włókien elastycznych, entropia i wariancja kołowa tego rozkładu, stopień krzywizny włókien elastycznych, ich odległość od złóż mineralnych.
• Analiza statystyczna danych multimodalnych w oparciu o odpowiednie testy statystyczne. Ze względu na stosunkowo niewielką liczbę dostępnych próbek ludzkich zostaną zastosowane a priori testy nieparametryczne (Wilcoxon-Mann-Whitney). Przebadanych zostanie co najmniej 8 pacjentów na grupę, co powinno wystarczyć ze względu na dokładność i powtarzalność zautomatyzowanych pomiarów. Jeśli u tego samego pacjenta wykonano kilka próbek lub serii obrazów, zostaną użyte zagnieżdżone testy statystyczne (zagnieżdżone testy t lub zagnieżdżone testy Wilcoxona).

W drugim kroku iw oparciu o wyniki pierwszego kroku różne elementy tego protokołu zostaną ulepszone, aby uzyskać dostęp do większej ilości informacji:

• Obrazowanie wielofotonowe zostanie wykonane w biopsjach nienaruszonej skóry mysiej, aby lepiej uwypuklić trójwymiarową organizację elastyny.
• Zaawansowane obrazowanie fluorescencyjne stanu zapalnego zostanie przeprowadzone na mysiej skórze ex vivo, przy użyciu pomiarów spektralnych lub FLIM (mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji)

• Do wizualizacji struktury złóż mineralnych zostanie wykorzystana generacja trzeciej harmonicznej (THG).

  1. Bazin D i in. Charakterystyka i niektóre aspekty fizykochemiczne patologicznych mikrozwapnień. Chem Rev. 10 października 2012;112(10):5092-120.
  2. H. Colboc i in. Lokalizacja, cechy morfologiczne i skład chemiczny złogów skórnych związanych z kalcyfilaksją u pacjentów z arteriolopatią wapniowo-mocznicową. JAMA Dermatologia 2019.
  3. H. Colboc i in. Charakterystyka fizykochemiczna złogów nieorganicznych związanych z ziarniniakami w sarkoidozie skórnej. Czasopismo Europejskiej Akademii Dermatologii i Wenerologii 2018.
  4. Haka AS i in. Identyfikacja mikrozwapnień w łagodnych i złośliwych zmianach piersi poprzez sondowanie różnic w ich składzie chemicznym za pomocą spektroskopii ramanowskiej. Rak Res. 15 września 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G i in. Kalcyfilaksja wywołana utratą masy ciała: potencjalna rola metaloproteinaz macierzy. Dermatol J. 2003;30(12):915-919.
  6. Schane-Klein MC. „L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques”. Fotoniki 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn i in. „Związane z wiekiem zmiany morfologiczne macierzy skórnej w skórze ludzkiej udokumentowane in vivo za pomocą mikroskopii wielofotonowej”. Dziennik optyki biomedycznej 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z. i in. „Ilościowa ocena morfologii elastyny ​​i kolagenu aorty i skóry w zespole Marfana za pomocą mikroskopii wielofotonowej”. Dziennik biologii strukturalnej 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, PL i in. „Ilościowe podejście do rozbioru histopatologicznego zaburzeń związanych z elastyną przy użyciu mikroskopii wielofotonowej”. British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire i M.-C. Schane-Klein, „Monitorowanie dynamicznej reorganizacji kolagenu podczas rozciągania skóry za pomocą szybkiego obrazowania SHG z rozdzielczością polaryzacyjną.” J. Biofot. 12, e201800336 (2019).