Изменение эластических волокон дермы при кальцифицирующем дерматозе: структурное исследование с использованием многофотонной микроскопии (Calciphoton)

Разнообразие патологий, сопровождающихся отложением минералов в тканях, велико (раковые заболевания, инфекционные процессы, экологические заболевания) (1). В дерматологии несколько патологий связаны с отложениями минералов кальция, такие как кальцифилаксия и эластическая псевдоксантома (PXE). На сегодняшний день проведено мало исследований химических характеристик кожных минеральных отложений, их физиопатологических последствий, возникновения сопутствующих патологий и их последствий для органов человека.

Это мотивировало докторскую диссертацию Hester COLBOC, M.D., по характеристике отложений кальция при различных кальцифицирующих дерматозах, включая кальцифилаксию (2) и саркоидоз (3). Этот фундаментальный исследовательский проект осуществляется в рамках сотрудничества между LCP (Институт физико-химии, CNRS, Университет Париж-Сакле) и AP-HP, в частности, в области уронефрологии (уролитиаз) и онкологии. (4) (кальцинаты при раке молочной железы и щитовидной железы). Мы показали, что кальцификаты кожи состоят из карбапатита при кальцифилаксии и кальцита при саркоидозе. Мы также показали, что эти отложения в основном расположены в эластичных волокнах дермы или стенки сосуда, что предполагает изучение пути молекулярной нуклеации в этих волокнах.

Это структурное и химическое описание является новаторским, но не отвечает на все вопросы, возникающие в связи с этими отложениями кальция: почему у некоторых пациентов с нормальным балансом фосфокальция наблюдаются массивные кальцинаты кожи? Почему, напротив, у других пациентов, например, у некоторых диализных больных, наблюдается крайне нарушенный фосфокальциевый баланс, но нет кальцификации кожи? Этот парадокс указывает на возможность существования «очагов зародышеобразования» в эластичных дермальных и сосудистых волокнах, способствующих осаждению фосфокальциевых отложений у некоторых пациентов. Некоторые модели in vitro исследовали эти очаги зарождения внутри эластических волокон. (ссылка Gourgas et al.) Примечательно, что большинству кальцифицирующих дерматозов предшествует кожное воспалительное состояние. Эти кожные воспалительные явления также могут вызывать осаждение отложений кальция. Таким образом, некоторые авторы предполагают, что эластин расщепляется металлопротеиназой (MMP) во внеклеточном матриксе, создавая таким образом очаги зародышеобразования, благоприятствующие фосфокальциевым отложениям. Мунавалли и др. показали повышение уровня ММП в образце мочи пациента с кальцифилаксией на фоне быстрой потери веса (5). Они предполагают, что повышенный уровень ММР в сыворотке у этого пациента может привести к изменению внешнего предела эластичности и кальцификации сосудов. С другой стороны, эта гипотеза подтверждается другими моделями изменения эластических волокон, например, при старении кожи (дерматопороз), при которых нет ни воспаления, ни кальцификации.

Основная гипотеза нашего проекта заключается в том, что воспаление кожи приводит к специфическим изменениям эластических волокон, что способствует их кальцификации.

Чтобы исследовать эту гипотезу, особенно во время кальцифилаксии и ПХЭ, мы предлагаем использовать многофотонную микроскопию, метод визуализации, доступный в Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) в Ecole Polytechnique. Многофотонная микроскопия была разработана в начале 1990-х годов как альтернатива конфокальной микроскопии для улучшения детального изображения биологических тканей с субмикрометрическим разрешением. Что наиболее важно, многофотонная микроскопия может комбинировать несколько участков контраста параллельно и без какой-либо маркировки для идентификации различных элементов ткани. Генерация второй гармоники (SHG) позволяет специфически визуализировать неокрашенный фибриллярный коллаген с непревзойденной чувствительностью, в то время как двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция (2PEF) позволяет визуализировать клетки благодаря различным собственным клеточным хромофорам, а также визуализации эластина в дерме или других тканях (см. Рисунок 1) (6).

Многофотонная микроскопия использовалась в нескольких исследованиях кожи, в том числе в LOB (см. рис. 1), которые доказали высокую значимость этого метода для структурной характеристики дермальных волокон, особенно эластиновых и коллагеновых волокон, и их возможных изменений. Он применялся для изучения старения кожи, а также патологий, приводящих к дегенерации эластических (PXE) или коллагеновых волокон (синдром Марфана) (7-9). Таким образом, этот метод очень подходит для изучения структуры эластических волокон при кожных воспалительных явлениях и кальцифицирующих дерматозах.

Параллельно кожный воспалительный процесс будет исследоваться другими методами. Иммуногистохимия будет использоваться для обнаружения кожных MMP, а рентгенофлуоресценция (на Synchrotron Soleil, линия Diffabs) будет использоваться для выявления внутрикожных отложений цинка и других металлов, как это было сделано в наших предыдущих исследованиях (рис. 2).

Рисунок 2: Рентгенофлуоресценция биоптата кожи: пример корреляции между кожным воспалительным инфильтратом (A) и наличием внутрикожного цинка (B), здесь во время лихеноидной реакции на татуировку (изображения, полученные на Soleil Synchrotron, линия Diffabs, С. Регера, Д. Базена и А. Колбока).

Основная цель нашего проекта - охарактеризовать структурные изменения эластических волокон при кальцифицирующем дерматозе.

Второстепенными целями являются:

• изучить последствия кожных воспалительных процессов на альтерацию эластических волокон,
• выявить возможные очаги зародышеобразования для образования фосфорно-кальциевых отложений внутри эластичных дермальных и сосудистых волокон.

Образцы кожи. Исследование будет в основном проводиться на коже человека, а также на мышиной модели PXE: мышь ABCC6 KO. Точнее, изучаемым в LOB материалом будет:

• Биопсии кожи человека уже взяты для диагностики этих кальцифицирующих дерматозов: PXE, кальцифилаксии, других кальцифицирующих воспалительных дерматозов (люпус-панникулит, дерматомиозит) в лаборатории патологии больницы Тенон (д-р Могелет).
• В качестве контроля использовались биопсии здоровой кожи пациентов разного возраста (край удаления опухоли кожи) из больницы Тенон. Мы сосредоточимся на пациентах с прогрессирующим старением кожи, особенно на пациентах с солнечным эластозом. Эта модель изменения эластических волокон, индуцированного УФ-излучением, является отличным контролем с точки зрения невоспалительных и некальцифицированных повреждений эластических волокон.
• Кожные биопсии мышиной модели PXE (мышь ABCC6 KO) и соответствующих контрольных мышей из INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Протоколы. Все эти биопсии будут охарактеризованы с помощью многофотонной микроскопии путем комбинирования контрастов 2PEF и SHG для одновременного изображения эластических и коллагеновых волокон. На первом этапе экспериментальный протокол будет следующим:

• Изготовление в больнице Тенон нескольких серийных препаратов из каждой биопсии: 1 неокрашенное («белое») стекло для многофотонной визуализации, 1 стекло с обычным морфологическим окрашиванием (гематоксилин-эозин-сафран, ГЭК), 1 стекло с окрашиванием, выделяющим отложения кальция (фон Косса). ) и 3 слайда с иммуногистохимической маркировкой основных ММП (антитела против ММП-1, 2 и 9).
• визуализация в LOB на стандартном светлопольном оптическом микроскопе (стандартный и поляризованный проходящий свет, флуоресценция, ДИК) всех окрашенных препаратов в большом поле зрения методом мозаики; определение областей интереса (ROI), соответствующих воспалительным процессам, ремоделированию тканей или минеральным отложениям. Обратите внимание, что месторождения полезных ископаемых выявляются в поляризованном проходящем свете, фазовом контрасте или ДИК.
• Рентгенофлуоресцентная визуализация на синхротроне Soleil для выявления металлических отложений, присутствующих в биоптатах, особенно цинка. Это будет сделано в сотрудничестве с Домиником Базеном (Институт физико-химии, CNRS, Университет Париж-Сакле), который имеет большой опыт в области визуализации минералов в линейке Diffabs.
• Многофотонная визуализация в LOB идентифицированных областях интереса или даже в большом поле зрения путем автоматического сшивания нескольких плиток. Изображения с поляризационным разрешением также будут выполняться в очень плотных областях или в ремоделированных областях, чтобы картировать направление волокон коллагена и эластина (10).
• Автоматизированный количественный анализ многофотонных LOB-изображений для измерения нескольких параметров, связанных с количеством и структурой эластина. Автоматизированный количественный анализ также будет выполняться для коллагена и других представляющих интерес структур, наблюдаемых на многофотонных изображениях или гистологических изображениях. Результаты различных модальностей визуализации будут сопоставлены на каждой серии слайдов. Обратите внимание, что автоматический анализ необходим как для того, чтобы избежать обычных погрешностей полуколичественного анализа, так и для получения более информативных структурных параметров. Например, из изображений эластина будут извлечены следующие параметры: средняя плотность эластических волокон (на см², в папиллярной дерме и в ретикулярной дерме), распределение ориентации эластических волокон, энтропия и круговая дисперсия. этого распределения, степень искривления эластических волокон, их удаленность от минеральных отложений.
• Статистический анализ мультимодальных данных на основе соответствующих статистических тестов. Априорные непараметрические тесты (Wilcoxon-Mann-Whitney) будут использоваться ввиду относительно небольшого количества доступных человеческих образцов. Будет исследовано как минимум 8 пациентов в группе, чего должно быть достаточно из-за точности и воспроизводимости автоматических измерений. Если для одного и того же пациента выполняется несколько образцов или серий изображений, будут использоваться вложенные статистические тесты (вложенные t-критерии или вложенные тесты Уилкоксона).

На втором этапе и на основе результатов первого этапа будут улучшены различные элементы этого протокола для доступа к дополнительной информации:

• Многофотонная визуализация будет проводиться в биоптатах неповрежденной кожи мышей, чтобы лучше выделить трехмерную организацию эластина.
• Усовершенствованная флуоресцентная визуализация воспаления будет выполняться в коже мышей ex vivo с использованием спектральных или FLIM (флуоресцентная визуализирующая микроскопия) измерений.

• Генерация третьей гармоники (THG) будет использоваться для визуализации структуры месторождений полезных ископаемых.

  1. Базен Д. и соавт. Характеристика и некоторые физико-химические аспекты патологических микрокальцинатов. Chem Rev. 10 октября 2012 г.; 112(10):5092-120.

Разнообразие патологий, сопровождающихся отложением минералов в тканях, велико (раковые заболевания, инфекционные процессы, экологические заболевания) (1). В дерматологии несколько патологий связаны с отложениями минералов кальция, такие как кальцифилаксия и эластическая псевдоксантома (PXE). На сегодняшний день проведено мало исследований химических характеристик кожных минеральных отложений, их физиопатологических последствий, возникновения сопутствующих патологий и их последствий для органов человека.

Это мотивировало докторскую диссертацию Hester COLBOC, M.D., по характеристике отложений кальция при различных кальцифицирующих дерматозах, включая кальцифилаксию (2) и саркоидоз (3). Этот фундаментальный исследовательский проект осуществляется в рамках сотрудничества между LCP (Институт физико-химии, CNRS, Университет Париж-Сакле) и AP-HP, в частности, в области уронефрологии (уролитиаз) и онкологии. (4) (кальцинаты при раке молочной железы и щитовидной железы). Мы показали, что кальцификаты кожи состоят из карбапатита при кальцифилаксии и кальцита при саркоидозе. Мы также показали, что эти отложения в основном расположены в эластичных волокнах дермы или стенки сосуда, что предполагает изучение пути молекулярной нуклеации в этих волокнах.

Это структурное и химическое описание является новаторским, но не отвечает на все вопросы, возникающие в связи с этими отложениями кальция: почему у некоторых пациентов с нормальным балансом фосфокальция наблюдаются массивные кальцинаты кожи? Почему, напротив, у других пациентов, например, у некоторых диализных больных, наблюдается крайне нарушенный фосфокальциевый баланс, но нет кальцификации кожи? Этот парадокс указывает на возможность существования «очагов зародышеобразования» в эластичных дермальных и сосудистых волокнах, способствующих осаждению фосфокальциевых отложений у некоторых пациентов. Некоторые модели in vitro исследовали эти очаги зарождения внутри эластических волокон. (ссылка Gourgas et al.) Примечательно, что большинству кальцифицирующих дерматозов предшествует кожное воспалительное состояние. Эти кожные воспалительные явления также могут вызывать осаждение отложений кальция. Таким образом, некоторые авторы предполагают, что эластин расщепляется металлопротеиназой (MMP) во внеклеточном матриксе, создавая таким образом очаги зародышеобразования, благоприятствующие фосфокальциевым отложениям. Мунавалли и др. показали повышение уровня ММП в образце мочи пациента с кальцифилаксией на фоне быстрой потери веса (5). Они предполагают, что повышенный уровень ММР в сыворотке у этого пациента может привести к изменению внешнего предела эластичности и кальцификации сосудов. С другой стороны, эта гипотеза подтверждается другими моделями изменения эластических волокон, например, при старении кожи (дерматопороз), при которых нет ни воспаления, ни кальцификации.

Основная гипотеза нашего проекта заключается в том, что воспаление кожи приводит к специфическим изменениям эластических волокон, что способствует их кальцификации.

Чтобы исследовать эту гипотезу, особенно во время кальцифилаксии и ПХЭ, мы предлагаем использовать многофотонную микроскопию, метод визуализации, доступный в Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) в Ecole Polytechnique. Многофотонная микроскопия была разработана в начале 1990-х годов как альтернатива конфокальной микроскопии для улучшения детального изображения биологических тканей с субмикрометрическим разрешением. Что наиболее важно, многофотонная микроскопия может комбинировать несколько участков контраста параллельно и без какой-либо маркировки для идентификации различных элементов ткани. Генерация второй гармоники (SHG) позволяет специфически визуализировать неокрашенный фибриллярный коллаген с непревзойденной чувствительностью, в то время как двухфотонно-возбуждаемая флуоресценция (2PEF) позволяет визуализировать клетки благодаря различным собственным клеточным хромофорам, а также визуализации эластина в дерме или других тканях (см. Рисунок 1) (6).

Многофотонная микроскопия использовалась в нескольких исследованиях кожи, в том числе в LOB (см. рис. 1), которые доказали высокую значимость этого метода для структурной характеристики дермальных волокон, особенно эластиновых и коллагеновых волокон, и их возможных изменений. Он применялся для изучения старения кожи, а также патологий, приводящих к дегенерации эластических (PXE) или коллагеновых волокон (синдром Марфана) (7-9). Таким образом, этот метод очень подходит для изучения структуры эластических волокон при кожных воспалительных явлениях и кальцифицирующих дерматозах.

Параллельно кожный воспалительный процесс будет исследоваться другими методами. Иммуногистохимия будет использоваться для обнаружения кожных MMP, а рентгенофлуоресценция (на Synchrotron Soleil, линия Diffabs) будет использоваться для выявления внутрикожных отложений цинка и других металлов, как это было сделано в наших предыдущих исследованиях (рис. 2).

Рисунок 2: Рентгенофлуоресценция биоптата кожи: пример корреляции между кожным воспалительным инфильтратом (A) и наличием внутрикожного цинка (B), здесь во время лихеноидной реакции на татуировку (изображения, полученные на Soleil Synchrotron, линия Diffabs, С. Регера, Д. Базена и А. Колбока).

Основная цель нашего проекта - охарактеризовать структурные изменения эластических волокон при кальцифицирующем дерматозе.

Второстепенными целями являются:

• изучить последствия кожных воспалительных процессов на альтерацию эластических волокон,
• выявить возможные очаги зародышеобразования для образования фосфорно-кальциевых отложений внутри эластичных дермальных и сосудистых волокон.

Образцы кожи. Исследование будет в основном проводиться на коже человека, а также на мышиной модели PXE: мышь ABCC6 KO. Точнее, изучаемым в LOB материалом будет:

• Биопсии кожи человека уже взяты для диагностики этих кальцифицирующих дерматозов: PXE, кальцифилаксии, других кальцифицирующих воспалительных дерматозов (люпус-панникулит, дерматомиозит) в лаборатории патологии больницы Тенон (д-р Могелет).
• В качестве контроля использовались биопсии здоровой кожи пациентов разного возраста (край удаления опухоли кожи) из больницы Тенон. Мы сосредоточимся на пациентах с прогрессирующим старением кожи, особенно на пациентах с солнечным эластозом. Эта модель изменения эластических волокон, индуцированного УФ-излучением, является отличным контролем с точки зрения невоспалительных и некальцифицированных повреждений эластических волокон.
• Кожные биопсии мышиной модели PXE (мышь ABCC6 KO) и соответствующих контрольных мышей из INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Протоколы. Все эти биопсии будут охарактеризованы с помощью многофотонной микроскопии путем комбинирования контрастов 2PEF и SHG для одновременного изображения эластических и коллагеновых волокон. На первом этапе экспериментальный протокол будет следующим:

• Изготовление в больнице Тенон нескольких серийных препаратов из каждой биопсии: 1 неокрашенное («белое») стекло для многофотонной визуализации, 1 стекло с обычным морфологическим окрашиванием (гематоксилин-эозин-сафран, ГЭК), 1 стекло с окрашиванием, выделяющим отложения кальция (фон Косса). ) и 3 слайда с иммуногистохимической маркировкой основных ММП (антитела против ММП-1, 2 и 9).
• визуализация в LOB на стандартном светлопольном оптическом микроскопе (стандартный и поляризованный проходящий свет, флуоресценция, ДИК) всех окрашенных препаратов в большом поле зрения методом мозаики; определение областей интереса (ROI), соответствующих воспалительным процессам, ремоделированию тканей или минеральным отложениям. Обратите внимание, что месторождения полезных ископаемых выявляются в поляризованном проходящем свете, фазовом контрасте или ДИК.
• Рентгенофлуоресцентная визуализация на синхротроне Soleil для выявления металлических отложений, присутствующих в биоптатах, особенно цинка. Это будет сделано в сотрудничестве с Домиником Базеном (Институт физико-химии, CNRS, Университет Париж-Сакле), который имеет большой опыт в области визуализации минералов в линейке Diffabs.
• Многофотонная визуализация в LOB идентифицированных областях интереса или даже в большом поле зрения путем автоматического сшивания нескольких плиток. Изображения с поляризационным разрешением также будут выполняться в очень плотных областях или в ремоделированных областях, чтобы картировать направление волокон коллагена и эластина (10).
• Автоматизированный количественный анализ многофотонных LOB-изображений для измерения нескольких параметров, связанных с количеством и структурой эластина. Автоматизированный количественный анализ также будет выполняться для коллагена и других представляющих интерес структур, наблюдаемых на многофотонных изображениях или гистологических изображениях. Результаты различных модальностей визуализации будут сопоставлены на каждой серии слайдов. Обратите внимание, что автоматический анализ необходим как для того, чтобы избежать обычных погрешностей полуколичественного анализа, так и для получения более информативных структурных параметров. Например, из изображений эластина будут извлечены следующие параметры: средняя плотность эластических волокон (на см², в папиллярной дерме и в ретикулярной дерме), распределение ориентации эластических волокон, энтропия и круговая дисперсия. этого распределения, степень искривления эластических волокон, их удаленность от минеральных отложений.
• Статистический анализ мультимодальных данных на основе соответствующих статистических тестов. Априорные непараметрические тесты (Wilcoxon-Mann-Whitney) будут использоваться ввиду относительно небольшого количества доступных человеческих образцов. Будет исследовано как минимум 8 пациентов в группе, чего должно быть достаточно из-за точности и воспроизводимости автоматических измерений. Если для одного и того же пациента выполняется несколько образцов или серий изображений, будут использоваться вложенные статистические тесты (вложенные t-критерии или вложенные тесты Уилкоксона).

На втором этапе и на основе результатов первого этапа будут улучшены различные элементы этого протокола для доступа к дополнительной информации:

• Многофотонная визуализация будет проводиться в биоптатах неповрежденной кожи мышей, чтобы лучше выделить трехмерную организацию эластина.
• Усовершенствованная флуоресцентная визуализация воспаления будет выполняться в коже мышей ex vivo с использованием спектральных или FLIM (флуоресцентная визуализирующая микроскопия) измерений.

• Генерация третьей гармоники (THG) будет использоваться для визуализации структуры месторождений полезных ископаемых.

  1. Базен Д. и соавт. Характеристика и некоторые физико-химические аспекты патологических микрокальцинатов. Chem Rev. 10 октября 2012 г.; 112(10):5092-120.
  2. Н. Колбок и др. Локализация, морфологические особенности и химический состав кожных отложений, связанных с кальцифилаксией, у пациентов с кальцифицирующей уремической артериолопатией. JAMA Дерматология 2019.
  3. Н. Колбок и др. Физико-химическая характеристика неорганических отложений, связанных с гранулемами при кожном саркоидозе. Журнал Европейской академии дерматологии и венерологии 2018.
  4. Хака А.С. и др. Выявление микрокальцинатов в доброкачественных и злокачественных образованиях молочной железы путем исследования различий в их химическом составе с помощью рамановской спектроскопии. Рак Рез. 15 сентября 2002 г.; 62(18):5375-80.
  5. Мунавалли Г. и соавт. Кальцифилаксия, вызванная потерей веса: потенциальная роль матриксных металлопротеиназ. J Дерматол. 2003;30(12):915-919.
  6. Шанн-Кляйн MC. "Многофотонные образы естественного и синтетического происхождения. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques». Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Ван, Хецюнь и др. «Возрастные морфологические изменения дермального матрикса в коже человека, документированные in vivo с помощью многофотонной микроскопии». Журнал биомедицинской оптики 23.3 (2018): 030501.
  8. Куи, Джейсон З. и др. «Количественная оценка морфологии эластина и коллагена аорты и кожи при синдроме Марфана с помощью многофотонной микроскопии». Журнал структурной биологии 187.3 (2014): 242-253.
  9. Тонг, П.Л., и соавт. «Количественный подход к гистопатологическому вскрытию заболеваний, связанных с эластином, с использованием многофотонной микроскопии». Британский журнал дерматологии 169.4 (2013): 869-879.
  10. Г. Дюкуртьяль, Ж.-С. Аффагард, М. Шмельц, Х. Солинас, М. Лопес-Понселас, К. Боно-Бидо, Р. Рубио-Амадор, Ф. Руджеро, Ж.-М. Аллен, Э. Борепэр и М.-К. Шанне-Кляйн, «Мониторинг динамической реорганизации коллагена во время растяжения кожи с помощью быстрой визуализации ГВГ с поляризационным разрешением». Дж. Биофот. 12, e201800336 (2019).