Verandering van huidelastische vezels tijdens verkalkende dermatose: structurele studie met behulp van multifotonenmicroscopie (Calciphoton)

De verscheidenheid aan pathologieën die gepaard gaan met minerale afzettingen in weefsels is groot (kankers, infectieuze processen, omgevingsziekten) (1). In de dermatologie worden verschillende pathologieën geassocieerd met calciummineraalafzettingen, zoals calciphylaxis en pseudoxanthoma elasticum (PXE). Tot op heden zijn er weinig studies uitgevoerd naar de chemische kenmerken van minerale afzettingen in de huid, hun fysiopathologische gevolgen, het optreden van bijbehorende pathologieën en hun weerslag op menselijke organen.

Dit heeft geleid tot het doctoraatsproject van Hester COLBOC, M.D., over de karakterisering van calciumafzettingen in verschillende verkalkende dermatosen, waaronder calciphylaxis (2) en sarcoïdose (3). Dit fundamenteel onderzoeksproject wordt uitgevoerd in het kader van een samenwerking tussen het LCP (Instituut voor Fysico-Chemie, CNRS, Université Paris-Saclay) en AP-HP, in het bijzonder op het gebied van uro-nefrologie (urinaire lithiasis) en oncologie (4) (calcificaties bij borst- en schildklierkanker). We hebben aangetoond dat huidverkalkingen bestaan ​​uit carbapatiet bij calciphylaxis en calciet bij sarcoïdose. We hebben ook aangetoond dat deze afzettingen zich voornamelijk in de elastische vezels van de dermale of vaatwand bevinden, wat suggereert dat er een moleculaire kiemvormingsroute binnen deze vezels moet worden onderzocht.

Deze structurele en chemische beschrijving is innovatief, maar beantwoordt niet alle vragen die rond deze kalkafzettingen rijzen: waarom hebben sommige patiënten, die een normale fosfocalciumbalans vertonen, enorme huidverkalkingen? Waarom vertonen andere patiënten, zoals sommige dialysepatiënten, juist een extreem verstoorde fosfocalcische balans, maar geen huidverkalking? Deze paradox verhoogt de mogelijkheid van het bestaan ​​van "nucleatiefoci" in de elastische dermale en vasculaire vezels, wat de precipitatie van fosfocalcische afzettingen bij sommige patiënten bevordert. Sommige in vitro modellen hebben deze nucleatiefoci in elastische vezels onderzocht. (ref Gourgas et al) Opmerkelijk genoeg worden de meeste verkalkende dermatosen voorafgegaan door een ontstekingstoestand van de huid. Deze huidontstekingsverschijnselen kunnen ook het neerslaan van kalkafzettingen veroorzaken. Sommige auteurs speculeren dus dat elastine wordt verteerd door metalloproteïnase (MMP) in de extracellulaire matrix, waardoor nucleatiefoci ontstaan ​​die fosfocalcische afzettingen bevorderen. Munavalli et al. toonde een toename van het MMP-niveau in het urinemonster van een patiënt met calcifylaxie in een context van snel gewichtsverlies (5). Ze veronderstellen dat verhoogde serum-MMP-waarden bij deze patiënt kunnen leiden tot een wijziging van de externe elastische limiet en vasculaire calcificaties. Deze hypothese wordt daarentegen ondersteund door andere modellen van verandering van elastische vezels, zoals tijdens huidveroudering (dermatoporose), waarbij er geen ontsteking en geen verkalking is.

De achtergrondhypothese van ons project is dat huidontsteking leidt tot een specifieke wijziging van de elastische vezels, wat bevorderlijk is voor hun verkalking.

Om deze hypothese te onderzoeken, met name tijdens calciphylaxis en PXE, stellen we voor om multifotonenmicroscopie te gebruiken, een beeldvormingstechniek die beschikbaar is bij het Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) aan de Ecole Polytechnique. Multifotonenmicroscopie is begin jaren negentig ontwikkeld als alternatief voor confocale microscopie, om diepgaande beeldvorming van biologische weefsels met submicrometrische resolutie te verbeteren. Het belangrijkste is dat multifotonenmicroscopie meerdere contrasten parallel en zonder enige labeling kan combineren om de verschillende elementen van een weefsel te identificeren. Signalen van de tweede harmonische generatie (SHG) maken specifieke beeldvorming mogelijk van ongekleurd fibrillair collageen met een ongeëvenaarde gevoeligheid, terwijl twee-foton geëxciteerde fluorescentie (2PEF) cellulaire beeldvorming mogelijk maakt dankzij verschillende intrinsieke cellulaire chromoforen en elastinebeeldvorming in de dermis of in andere weefsels (zie Afbeelding 1) (6).

Multifotonenmicroscopie is gebruikt in verschillende onderzoeken naar de huid, waaronder bij LOB (zie figuur 1), die hebben bewezen dat deze techniek zeer relevant is voor de structurele karakterisering van huidvezels, met name elastine- en collageenvezels, en hun mogelijke verandering. Het is toegepast bij de studie van huidveroudering, evenals bij pathologieën die leiden tot degeneratie van elastische (PXE) of collageenvezels (syndroom van Marfan) (7-9). Deze techniek is dan ook uitermate geschikt om de structuur van elastische vezels te onderzoeken bij cutane ontstekingsverschijnselen en verkalkende dermatosen.

Tegelijkertijd zal het ontstekingsproces van de huid met andere methoden worden onderzocht. Immunohistochemie zal worden gebruikt om dermale MMP te detecteren en röntgenfluorescentie (bij Synchrotron Soleil, Diffabs-lijn) zal worden gebruikt om intradermale zink- en andere metaalafzettingen aan te tonen, zoals gedaan in onze eerdere studies (Figuur 2).

Figuur 2: Röntgenfluorescentie van een huidbiopsie: voorbeeld van correlatie tussen dermaal inflammatoir infiltraat (A) en de aanwezigheid van intradermaal zink (B), hier tijdens een lichenoïde reactie op tatoeage (beelden opgenomen op de Soleil Synchrotron, Diffabs-lijn, door S. Reguer, D. Bazin en H. Colboc).

Het hoofddoel van ons project is het karakteriseren van de structurele veranderingen van elastische vezels tijdens verkalkende dermatose.

De secundaire doelstellingen zijn:

• om de gevolgen van huidontstekingsprocessen op de verandering van elastische vezels te bestuderen,
• om mogelijke nucleatiehaarden te identificeren voor de vorming van fosfo-calciumafzettingen in de elastische dermale en vasculaire vezels.

Huidmonsters. De studie zal voornamelijk uitgevoerd worden op de menselijke huid, maar ook op een muismodel van PXE: ABCC6 KO muis. Meer precies, het materiaal dat bij LOB wordt bestudeerd, is:

• Menselijke huidbiopten die al zijn afgenomen voor de diagnose van deze verkalkende dermatosen: PXE, calcifylaxie, andere verkalkende inflammatoire dermatosen (lupus panniculitis, dermatomyositis), van het pathologielaboratorium van het Tenon-ziekenhuis (Dr. Moguelet).
• Als controles, menselijke biopsieën van gezonde huid van patiënten van verschillende leeftijden, (marge van huidtumorverwijdering), van het Tenon Hospital. We zullen ons richten op patiënten met gevorderde huidveroudering, vooral patiënten met zonne-elastose. Dit model van UV-geïnduceerde verandering van elastische vezels is een geweldige controle in termen van niet-inflammatoire en niet-verkalkte elastische vezelbeschadigingen.
• Huidbiopten van het muismodel van PXE (ABCC6 KO-muis) en van gematchte controlemuizen, van INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocollen. Al deze biopsieën zullen worden gekarakteriseerd door multifotonenmicroscopie door 2PEF- en SHG-contrasten te combineren om tegelijkertijd elastische en collageenvezels in beeld te brengen. In een eerste stap zal het experimentele protocol als volgt zijn:

• Productie in Tenon Hospital van verschillende seriële objectglaasjes van elke biopsie: 1 ongekleurd ("wit") objectglaasje voor beeldvorming met meerdere fotonen, 1 objectglaasje met gebruikelijke morfologische kleuring (hematoxyline-eosine-safran, HES), 1 objectglaasje met kleuring die calciumafzettingen benadrukt (Von Kossa ) en 3 objectglaasjes met immunohistochemische labeling van de belangrijkste MMP's (antilichamen tegen MMP-1, 2 en 9).
• beeldvorming bij LOB op een standaard optische microscoop met helder veld (standaard en gepolariseerd doorvallend licht, fluorescentie, DIC) van alle gekleurde objectglaasjes over een groot gezichtsveld door mozaïekvorming; identificatie van interessegebieden (ROI) die overeenkomen met ontstekingsprocessen, weefselremodellering of minerale afzettingen. Merk op dat minerale afzettingen worden onthuld door gepolariseerd doorvallend licht of door fasecontrast of DIC.
• Röntgenfluorescentiebeeldvorming bij Soleil Synchrotron om de metaalafzettingen in de biopsieën te identificeren, met name zink. Dit zal gebeuren in samenwerking met Dominique Bazin (Instituut voor Fysico-Chemie, CNRS, Paris-Saclay University), die een sterke expertise heeft in minerale beeldvorming in de Diffabs-lijn.
• Multiphoton-beeldvorming bij LOB van de geïdentificeerde interessegebieden, of zelfs op een groot gezichtsveld door automatisch meerdere tegels te naaien. Polarisatie-opgeloste beelden zullen ook worden uitgevoerd in zeer dichte gebieden of in hermodelleerde gebieden om de richting van collageen- en elastinevezels in kaart te brengen (10).
• Geautomatiseerde kwantitatieve analyse van multiphoton LOB-beelden om verschillende parameters te meten die verband houden met de hoeveelheid en structuur van elastine. Geautomatiseerde kwantitatieve analyses zullen ook worden uitgevoerd op collageen en andere interessante structuren die worden waargenomen op multifotonenbeelden of histologische beelden. De resultaten van de verschillende beeldvormingsmodaliteiten zullen op elke serie objectglaasjes worden gecorreleerd. Merk op dat automatische analyse essentieel is om zowel de gebruikelijke vooroordelen van semi-kwantitatieve analyse te vermijden als om meer informatieve structurele parameters te verkrijgen. Zo zullen de volgende parameters uit de elastinebeelden gehaald worden: de gemiddelde dichtheid van de elastische vezels (per cm², in de papillaire dermis en in de reticulaire dermis), de oriëntatieverdeling van de elastische vezels, de entropie en de circulaire variantie van deze verdeling, de mate van kromming van de elastische vezels, hun afstand tot de minerale afzettingen.
• Statistische analyse van multimodale gegevens, gebaseerd op geschikte statistische tests. A priori niet-parametrische tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) zullen worden gebruikt gezien het relatief kleine aantal beschikbare menselijke monsters. Er zullen minimaal 8 patiënten per groep worden bestudeerd, wat voldoende zou moeten zijn vanwege de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de geautomatiseerde metingen. Als er meerdere monsters of beeldreeksen op dezelfde patiënt worden uitgevoerd, worden geneste statistische tests gebruikt (geneste t-testen of geneste Wilcoxon).

In een tweede stap en op basis van de resultaten van de eerste stap zullen verschillende items van dit protocol worden verbeterd om toegang te krijgen tot meer informatie:

• Multiphoton-beeldvorming zal worden uitgevoerd in intacte huidbiopsieën van muizen om de 3D-organisatie van elastine beter te benadrukken.
• Geavanceerde fluorescentiebeeldvorming van ontsteking zal worden uitgevoerd in ex vivo muriene huid, met behulp van spectrale of FLIM-metingen (fluorescentielevensduurbeeldmicroscopie)

• Third Harmonic Generation (THG) zal worden gebruikt om de structuur van de minerale afzettingen te visualiseren.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering en enkele fysisch-chemische aspecten van pathologische microcalcificaties. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.

De verscheidenheid aan pathologieën die gepaard gaan met minerale afzettingen in weefsels is groot (kankers, infectieuze processen, omgevingsziekten) (1). In de dermatologie worden verschillende pathologieën geassocieerd met calciummineraalafzettingen, zoals calciphylaxis en pseudoxanthoma elasticum (PXE). Tot op heden zijn er weinig studies uitgevoerd naar de chemische kenmerken van minerale afzettingen in de huid, hun fysiopathologische gevolgen, het optreden van bijbehorende pathologieën en hun weerslag op menselijke organen.

Dit heeft geleid tot het doctoraatsproject van Hester COLBOC, M.D., over de karakterisering van calciumafzettingen in verschillende verkalkende dermatosen, waaronder calciphylaxis (2) en sarcoïdose (3). Dit fundamenteel onderzoeksproject wordt uitgevoerd in het kader van een samenwerking tussen het LCP (Instituut voor Fysico-Chemie, CNRS, Université Paris-Saclay) en AP-HP, in het bijzonder op het gebied van uro-nefrologie (urinaire lithiasis) en oncologie (4) (calcificaties bij borst- en schildklierkanker). We hebben aangetoond dat huidverkalkingen bestaan ​​uit carbapatiet bij calciphylaxis en calciet bij sarcoïdose. We hebben ook aangetoond dat deze afzettingen zich voornamelijk in de elastische vezels van de dermale of vaatwand bevinden, wat suggereert dat er een moleculaire kiemvormingsroute binnen deze vezels moet worden onderzocht.

Deze structurele en chemische beschrijving is innovatief, maar beantwoordt niet alle vragen die rond deze kalkafzettingen rijzen: waarom hebben sommige patiënten, die een normale fosfocalciumbalans vertonen, enorme huidverkalkingen? Waarom vertonen andere patiënten, zoals sommige dialysepatiënten, juist een extreem verstoorde fosfocalcische balans, maar geen huidverkalking? Deze paradox verhoogt de mogelijkheid van het bestaan ​​van "nucleatiefoci" in de elastische dermale en vasculaire vezels, wat de precipitatie van fosfocalcische afzettingen bij sommige patiënten bevordert. Sommige in vitro modellen hebben deze nucleatiefoci in elastische vezels onderzocht. (ref Gourgas et al) Opmerkelijk genoeg worden de meeste verkalkende dermatosen voorafgegaan door een ontstekingstoestand van de huid. Deze huidontstekingsverschijnselen kunnen ook het neerslaan van kalkafzettingen veroorzaken. Sommige auteurs speculeren dus dat elastine wordt verteerd door metalloproteïnase (MMP) in de extracellulaire matrix, waardoor nucleatiefoci ontstaan ​​die fosfocalcische afzettingen bevorderen. Munavalli et al. toonde een toename van het MMP-niveau in het urinemonster van een patiënt met calcifylaxie in een context van snel gewichtsverlies (5). Ze veronderstellen dat verhoogde serum-MMP-waarden bij deze patiënt kunnen leiden tot een wijziging van de externe elastische limiet en vasculaire calcificaties. Deze hypothese wordt daarentegen ondersteund door andere modellen van verandering van elastische vezels, zoals tijdens huidveroudering (dermatoporose), waarbij er geen ontsteking en geen verkalking is.

De achtergrondhypothese van ons project is dat huidontsteking leidt tot een specifieke wijziging van de elastische vezels, wat bevorderlijk is voor hun verkalking.

Om deze hypothese te onderzoeken, met name tijdens calciphylaxis en PXE, stellen we voor om multifotonenmicroscopie te gebruiken, een beeldvormingstechniek die beschikbaar is bij het Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) aan de Ecole Polytechnique. Multifotonenmicroscopie is begin jaren negentig ontwikkeld als alternatief voor confocale microscopie, om diepgaande beeldvorming van biologische weefsels met submicrometrische resolutie te verbeteren. Het belangrijkste is dat multifotonenmicroscopie meerdere contrasten parallel en zonder enige labeling kan combineren om de verschillende elementen van een weefsel te identificeren. Signalen van de tweede harmonische generatie (SHG) maken specifieke beeldvorming mogelijk van ongekleurd fibrillair collageen met een ongeëvenaarde gevoeligheid, terwijl twee-foton geëxciteerde fluorescentie (2PEF) cellulaire beeldvorming mogelijk maakt dankzij verschillende intrinsieke cellulaire chromoforen en elastinebeeldvorming in de dermis of in andere weefsels (zie Afbeelding 1) (6).

Multifotonenmicroscopie is gebruikt in verschillende onderzoeken naar de huid, waaronder bij LOB (zie figuur 1), die hebben bewezen dat deze techniek zeer relevant is voor de structurele karakterisering van huidvezels, met name elastine- en collageenvezels, en hun mogelijke verandering. Het is toegepast bij de studie van huidveroudering, evenals bij pathologieën die leiden tot degeneratie van elastische (PXE) of collageenvezels (syndroom van Marfan) (7-9). Deze techniek is dan ook uitermate geschikt om de structuur van elastische vezels te onderzoeken bij cutane ontstekingsverschijnselen en verkalkende dermatosen.

Tegelijkertijd zal het ontstekingsproces van de huid met andere methoden worden onderzocht. Immunohistochemie zal worden gebruikt om dermale MMP te detecteren en röntgenfluorescentie (bij Synchrotron Soleil, Diffabs-lijn) zal worden gebruikt om intradermale zink- en andere metaalafzettingen aan te tonen, zoals gedaan in onze eerdere studies (Figuur 2).

Figuur 2: Röntgenfluorescentie van een huidbiopsie: voorbeeld van correlatie tussen dermaal inflammatoir infiltraat (A) en de aanwezigheid van intradermaal zink (B), hier tijdens een lichenoïde reactie op tatoeage (beelden opgenomen op de Soleil Synchrotron, Diffabs-lijn, door S. Reguer, D. Bazin en H. Colboc).

Het hoofddoel van ons project is het karakteriseren van de structurele veranderingen van elastische vezels tijdens verkalkende dermatose.

De secundaire doelstellingen zijn:

• om de gevolgen van huidontstekingsprocessen op de verandering van elastische vezels te bestuderen,
• om mogelijke nucleatiehaarden te identificeren voor de vorming van fosfo-calciumafzettingen in de elastische dermale en vasculaire vezels.

Huidmonsters. De studie zal voornamelijk uitgevoerd worden op de menselijke huid, maar ook op een muismodel van PXE: ABCC6 KO muis. Meer precies, het materiaal dat bij LOB wordt bestudeerd, is:

• Menselijke huidbiopten die al zijn afgenomen voor de diagnose van deze verkalkende dermatosen: PXE, calcifylaxie, andere verkalkende inflammatoire dermatosen (lupus panniculitis, dermatomyositis), van het pathologielaboratorium van het Tenon-ziekenhuis (Dr. Moguelet).
• Als controles, menselijke biopsieën van gezonde huid van patiënten van verschillende leeftijden, (marge van huidtumorverwijdering), van het Tenon Hospital. We zullen ons richten op patiënten met gevorderde huidveroudering, vooral patiënten met zonne-elastose. Dit model van UV-geïnduceerde verandering van elastische vezels is een geweldige controle in termen van niet-inflammatoire en niet-verkalkte elastische vezelbeschadigingen.
• Huidbiopten van het muismodel van PXE (ABCC6 KO-muis) en van gematchte controlemuizen, van INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocollen. Al deze biopsieën zullen worden gekarakteriseerd door multifotonenmicroscopie door 2PEF- en SHG-contrasten te combineren om tegelijkertijd elastische en collageenvezels in beeld te brengen. In een eerste stap zal het experimentele protocol als volgt zijn:

• Productie in Tenon Hospital van verschillende seriële objectglaasjes van elke biopsie: 1 ongekleurd ("wit") objectglaasje voor beeldvorming met meerdere fotonen, 1 objectglaasje met gebruikelijke morfologische kleuring (hematoxyline-eosine-safran, HES), 1 objectglaasje met kleuring die calciumafzettingen benadrukt (Von Kossa ) en 3 objectglaasjes met immunohistochemische labeling van de belangrijkste MMP's (antilichamen tegen MMP-1, 2 en 9).
• beeldvorming bij LOB op een standaard optische microscoop met helder veld (standaard en gepolariseerd doorvallend licht, fluorescentie, DIC) van alle gekleurde objectglaasjes over een groot gezichtsveld door mozaïekvorming; identificatie van interessegebieden (ROI) die overeenkomen met ontstekingsprocessen, weefselremodellering of minerale afzettingen. Merk op dat minerale afzettingen worden onthuld door gepolariseerd doorvallend licht of door fasecontrast of DIC.
• Röntgenfluorescentiebeeldvorming bij Soleil Synchrotron om de metaalafzettingen in de biopsieën te identificeren, met name zink. Dit zal gebeuren in samenwerking met Dominique Bazin (Instituut voor Fysico-Chemie, CNRS, Paris-Saclay University), die een sterke expertise heeft in minerale beeldvorming in de Diffabs-lijn.
• Multiphoton-beeldvorming bij LOB van de geïdentificeerde interessegebieden, of zelfs op een groot gezichtsveld door automatisch meerdere tegels te naaien. Polarisatie-opgeloste beelden zullen ook worden uitgevoerd in zeer dichte gebieden of in hermodelleerde gebieden om de richting van collageen- en elastinevezels in kaart te brengen (10).
• Geautomatiseerde kwantitatieve analyse van multiphoton LOB-beelden om verschillende parameters te meten die verband houden met de hoeveelheid en structuur van elastine. Geautomatiseerde kwantitatieve analyses zullen ook worden uitgevoerd op collageen en andere interessante structuren die worden waargenomen op multifotonenbeelden of histologische beelden. De resultaten van de verschillende beeldvormingsmodaliteiten zullen op elke serie objectglaasjes worden gecorreleerd. Merk op dat automatische analyse essentieel is om zowel de gebruikelijke vooroordelen van semi-kwantitatieve analyse te vermijden als om meer informatieve structurele parameters te verkrijgen. Zo zullen de volgende parameters uit de elastinebeelden gehaald worden: de gemiddelde dichtheid van de elastische vezels (per cm², in de papillaire dermis en in de reticulaire dermis), de oriëntatieverdeling van de elastische vezels, de entropie en de circulaire variantie van deze verdeling, de mate van kromming van de elastische vezels, hun afstand tot de minerale afzettingen.
• Statistische analyse van multimodale gegevens, gebaseerd op geschikte statistische tests. A priori niet-parametrische tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) zullen worden gebruikt gezien het relatief kleine aantal beschikbare menselijke monsters. Er zullen minimaal 8 patiënten per groep worden bestudeerd, wat voldoende zou moeten zijn vanwege de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de geautomatiseerde metingen. Als er meerdere monsters of beeldreeksen op dezelfde patiënt worden uitgevoerd, worden geneste statistische tests gebruikt (geneste t-testen of geneste Wilcoxon).

In een tweede stap en op basis van de resultaten van de eerste stap zullen verschillende items van dit protocol worden verbeterd om toegang te krijgen tot meer informatie:

• Multiphoton-beeldvorming zal worden uitgevoerd in intacte huidbiopsieën van muizen om de 3D-organisatie van elastine beter te benadrukken.
• Geavanceerde fluorescentiebeeldvorming van ontsteking zal worden uitgevoerd in ex vivo muriene huid, met behulp van spectrale of FLIM-metingen (fluorescentielevensduurbeeldmicroscopie)

• Third Harmonic Generation (THG) zal worden gebruikt om de structuur van de minerale afzettingen te visualiseren.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering en enkele fysisch-chemische aspecten van pathologische microcalcificaties. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.
  2. H. Colboc, et al. Lokalisatie, morfologische kenmerken en chemische samenstelling van calciphylaxis-gerelateerde huidafzettingen bij patiënten met gecalcificeerde uremische arteriolopathie. JAMA Dermatologie 2019.
  3. H. Colboc, et al. Fysisch-chemische karakterisering van anorganische afzettingen geassocieerd met granulomen bij cutane sarcoïdose. Tijdschrift van de European Academy of Dermatology and Venereology 2018.
  4. Haka AS, et al. Identificatie van microcalcificaties in goedaardige en kwaadaardige borstlaesies door verschillen in hun chemische samenstelling te onderzoeken met behulp van Raman-spectroscopie. kanker res. 15 september 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Gewichtsverlies-geïnduceerde calciphylaxis: mogelijke rol van matrixmetalloproteïnasen. J dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein MC. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Fotonica 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Leeftijdsgerelateerde morfologische veranderingen van de huidmatrix in de menselijke huid in vivo gedocumenteerd door multifotonenmicroscopie." Tijdschrift voor biomedische optica 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Kwantificering van aorta- en cutane elastine- en collageenmorfologie bij het Marfan-syndroom door multifotonenmicroscopie." Tijdschrift voor structurele biologie 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "Een kwantitatieve benadering van histopathologische dissectie van elastinegerelateerde aandoeningen met behulp van multifotonenmicroscopie." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidad, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire en M.-C. Schanne-Klein, "Bewaking van dynamische reorganisatie van collageen tijdens het strekken van de huid met snelle polarisatie-opgeloste SHG-beeldvorming." J. Biofoto. 12, e201800336 (2019).