Změna dermálních elastických vláken během kalcifikující dermatózy: strukturální studie pomocí multifotonové mikroskopie (Calciphoton)

Rozmanitost patologických stavů doprovázených minerálními depozity v tkáních je velká (rakovina, infekční procesy, onemocnění životního prostředí) (1). V dermatologii je několik patologií spojeno s usazeninami vápníku, jako je kalcifylaxe a pseudoxanthoma elasticum (PXE). Dosud bylo provedeno jen málo studií o chemických vlastnostech kožních minerálních ložisek, jejich fyziopatologických důsledcích, výskytu souvisejících patologií a jejich dopadech na lidské orgány.

To motivovalo doktorandský projekt Hester COLBOC, M.D., na charakterizaci kalciových depozit u různých kalcifikujících dermatóz, včetně kalcifylaxe (2) a sarkoidózy (3). Tento základní výzkumný projekt je realizován v rámci spolupráce mezi LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) a AP-HP, zejména v oblastech uro-nefrologie (močová litiáza) a onkologie. (4) (kalcifikace u rakoviny prsu a štítné žlázy). Ukázali jsme, že kožní kalcifikace se skládají z karbapatitu u kalcifylaxe a kalcitu u sarkoidózy. Také jsme ukázali, že tyto depozita se nacházejí hlavně v dermálních vláknech nebo elastických vláknech cévní stěny, což naznačuje cestu molekulární nukleace v těchto vláknech, která by měla být prozkoumána.

Tento strukturní a chemický popis je inovativní, ale neodpovídá na všechny otázky, které se kolem těchto vápenatých usazenin objevují: proč mají někteří pacienti, kteří vykazují normální rovnováhu fosfokalcia, masivní kožní kalcifikace? Proč naopak jiní pacienti, např. někteří dialyzovaní pacienti, vykazují extrémně narušené fosfokalcické bilance, ale žádnou kalcifikaci kůže? Tento paradox zvyšuje možnost existence "nukleačních ložisek" v elastických dermálních a vaskulárních vláknech, což u některých pacientů podporuje precipitaci fosfokalcických depozit. Některé in vitro modely zkoumaly tato nukleační ložiska v elastických vláknech. (ref Gourgas et al) Je pozoruhodné, že většině kalcifikujících dermatóz předchází kožní zánětlivý stav. Tyto kožní zánětlivé jevy mohou také vyvolat srážení vápenatých usazenin. Někteří autoři tak spekulují, že elastin je štěpen metaloproteinázou (MMP) v extracelulární matrix, čímž se vytvářejí nukleační ložiska zvýhodňující fosfokalcikové depozita. Munavalli a kol. prokázali zvýšení hladiny MMP ve vzorku moči pacienta s kalcifylaxí v kontextu rychlého úbytku hmotnosti (5). Předpokládají, že zvýšené hladiny MMP v séru u tohoto pacienta by mohly vést ke změně vnějšího elastického limitu a vaskulárním kalcifikacím. Tuto hypotézu podporují na druhé straně další modely alterace elastických vláken, např. při stárnutí kůže (dermatoporóza), kdy nedochází k zánětu a kalcifikace.

Základní hypotézou našeho projektu je, že zánět kůže vede ke specifické alteraci elastických vláken, což vede k jejich kalcifikaci.

Abychom prozkoumali tuto hypotézu, zejména během kalcifylaxe a PXE, navrhujeme použít multifotonovou mikroskopii, zobrazovací techniku ​​dostupnou v Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) na Ecole Polytechnique. Multifotonová mikroskopie byla vyvinuta na počátku 90. let jako alternativa ke konfokální mikroskopii, aby se zlepšilo hloubkové zobrazování biologických tkání se submikrometrickým rozlišením. A co je nejdůležitější, multifotonová mikroskopie může kombinovat několik žil kontrastu paralelně a bez jakéhokoli označení k identifikaci různých prvků tkáně. Signály druhé harmonické generace (SHG) umožňují specifické zobrazení nebarveného fibrilárního kolagenu s nesrovnatelnou citlivostí, zatímco dvoufotonová excitovaná fluorescence (2PEF) umožňuje buněčné zobrazení díky různým vnitřním buněčným chromoforům a také zobrazení elastinu v dermis nebo v jiných tkáních (viz. Obrázek 1) (6).

Multifotonová mikroskopie byla použita v několika studiích na kůži, včetně LOB (viz obrázek 1), které prokázaly vysokou relevanci této techniky pro strukturální charakterizaci dermálních vláken, zejména elastinových a kolagenových vláken, a jejich možné změny. Byl aplikován při studiu stárnutí kůže, stejně jako u patologií vedoucích k degeneraci elastických (PXE) nebo kolagenových vláken (Marfanův syndrom) (7-9). Tato technika je proto velmi vhodná pro zkoumání struktury elastických vláken při kožních zánětlivých jevech a kalcifikujících dermatózách.

Souběžně s tím bude kožní zánětlivý proces zkoumán jinými metodami. Imunohistochemie bude použita k detekci dermální MMP a rentgenová fluorescence (na Synchrotron Soleil, řada Diffabs) bude použita k průkazu intradermálních zinkových a jiných kovových usazenin, jak bylo provedeno v našich předchozích studiích (obrázek 2).

Obrázek 2: Rentgenová fluorescence kožní biopsie: příklad korelace mezi dermálním zánětlivým infiltrátem (A) a přítomností intradermálního zinku (B), zde během lichenoidní reakce na tetování (snímky zaznamenané na Soleil Synchrotron, Diffabs line, od S. Reguera, D. Bazina a H. Colboca).

Hlavním cílem našeho projektu je charakterizovat strukturální změny elastických vláken při kalcifikující dermatóze.

Sekundární cíle jsou:

• studovat důsledky kožních zánětlivých procesů na alteraci elastických vláken,
• k identifikaci možných nukleačních ložisek pro tvorbu fosfo-vápenatých depozit v elastických dermálních a vaskulárních vláknech.

Vzorky kůže. Studie bude prováděna především na lidské kůži, ale také na myším modelu myši PXE: ABCC6 KO. Přesněji řečeno, materiál studovaný na LOB bude:

• Biopsie lidské kůže již odebrané pro diagnostiku těchto kalcifikujících dermatóz: PXE, kalcifylaxe, jiné kalcifikující zánětlivé dermatózy (lupus panniculitis, dermatomyositis) z patologické laboratoře nemocnice Tenon (Dr Moguelet).
• Jako kontroly byly použity lidské biopsie zdravé kůže od pacientů různého věku (okraj odstranění kožního nádoru) z nemocnice Tenon. Zaměříme se na pacienty s pokročilým stárnutím kůže, zejména pacienty se solární elastózou. Tento model UV indukované alterace elastických vláken je skvělou kontrolou z hlediska nezánětlivého a nekalcifikovaného poškození elastických vláken.
• Kožní biopsie z myšího modelu PXE (ABCC6 KO myš) a z odpovídajících kontrolních myší z INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoly. Všechny tyto biopsie budou charakterizovány multifotonovou mikroskopií kombinací kontrastů 2PEF a SHG za účelem současného zobrazení elastických a kolagenových vláken. V prvním kroku bude experimentální protokol následující:

• Výroba několika sériových preparátů z každé biopsie v nemocnici Tenon: 1 nebarvené („bílé“) sklíčko pro multifotonové zobrazování, 1 sklíčko s obvyklým morfologickým barvením (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 sklíčko s barvením zvýrazňujícím usazeniny vápníku (Von Kossa ) a 3 sklíčka s imunohistochemickým značením hlavních MMP (protilátky proti MMP-1, 2 a 9).
• zobrazení na LOB na standardním optickém mikroskopu ve světlém poli (standardní a polarizované procházející světlo, fluorescence, DIC) všech obarvených preparátů přes velké zorné pole mozaikováním; identifikace oblastí zájmu (ROI) odpovídajících zánětlivým procesům, tkáňové remodelaci nebo minerálním depozitům. Všimněte si, že minerální usazeniny jsou odhaleny polarizovaným procházejícím světlem nebo fázovým kontrastem nebo DIC.
• Rentgenové fluorescenční zobrazování na Soleil Synchrotron k identifikaci kovových usazenin přítomných v biopsiích, zejména zinku. To bude provedeno ve spolupráci s Dominique Bazinem (Fyzikálně-chemický institut, CNRS, Paris-Saclay University), který má silné odborné znalosti v oblasti zobrazování minerálů v řadě Diffabs.
• Multifotonové zobrazování v LOB identifikovaných oblastí zájmu nebo dokonce ve velkém zorném poli automatickým sešíváním několika dlaždic. Snímky s rozlišením polarizace budou také prováděny ve velmi hustých oblastech nebo v remodelovaných oblastech, aby bylo možné zmapovat směr kolagenových a elastinových vláken (10).
• Automatizovaná kvantitativní analýza multifotonových LOB snímků pro měření několika parametrů souvisejících s množstvím a strukturou elastinu. Automatizované kvantitativní analýzy budou také prováděny na kolagenu a dalších strukturách zájmu pozorovaných na multifotonových snímcích nebo histologických snímcích. Výsledky různých zobrazovacích modalit budou korelovány na každé sérii preparátů. Všimněte si, že automatická analýza je nezbytná jak pro zamezení obvyklých zkreslení semikvantitativní analýzy, tak pro získání více informativních strukturálních parametrů. Z elastinových snímků budou například extrahovány následující parametry: střední hustota elastických vláken (na cm², v papilární dermis a v retikulární dermis), rozložení orientace elastických vláken, entropie a kruhový rozptyl tohoto rozdělení, stupeň zakřivení elastických vláken, jejich vzdálenost od minerálních ložisek.
• Statistická analýza multimodálních dat na základě vhodných statistických testů. Vzhledem k relativně malému počtu dostupných lidských vzorků budou použity a priori neparametrické testy (Wilcoxon-Mann-Whitney). Bude studováno minimálně 8 pacientů na skupinu, což by mělo být dostatečné vzhledem k přesnosti a reprodukovatelnosti automatizovaných měření. Pokud se u stejného pacienta provádí několik vzorků nebo sérií snímků, použijí se vnořené statistické testy (vnořené t-testy nebo vnořené Wilcoxonovy testy).

Ve druhém kroku a na základě výsledků prvního kroku budou různé položky tohoto protokolu vylepšeny, aby bylo možné získat více informací:

• Multifotonové zobrazování bude prováděno v biopsiích neporušené myší kůže, aby se lépe zvýraznila 3D organizace elastinu.
• Pokročilé fluorescenční zobrazování zánětu bude prováděno na myší kůži ex vivo pomocí spektrálních nebo FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) měření

• Třetí harmonická generace (THG) bude použita k vizualizaci struktury ložisek nerostů.

  1. Bazin D, a kol. Charakterizace a některé fyzikálně-chemické aspekty patologických mikrokalcifikací. Chem Rev. 10. října 2012;112(10):5092-120.

Rozmanitost patologických stavů doprovázených minerálními depozity v tkáních je velká (rakovina, infekční procesy, onemocnění životního prostředí) (1). V dermatologii je několik patologií spojeno s usazeninami vápníku, jako je kalcifylaxe a pseudoxanthoma elasticum (PXE). Dosud bylo provedeno jen málo studií o chemických vlastnostech kožních minerálních ložisek, jejich fyziopatologických důsledcích, výskytu souvisejících patologií a jejich dopadech na lidské orgány.

To motivovalo doktorandský projekt Hester COLBOC, M.D., na charakterizaci kalciových depozit u různých kalcifikujících dermatóz, včetně kalcifylaxe (2) a sarkoidózy (3). Tento základní výzkumný projekt je realizován v rámci spolupráce mezi LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) a AP-HP, zejména v oblastech uro-nefrologie (močová litiáza) a onkologie. (4) (kalcifikace u rakoviny prsu a štítné žlázy). Ukázali jsme, že kožní kalcifikace se skládají z karbapatitu u kalcifylaxe a kalcitu u sarkoidózy. Také jsme ukázali, že tyto depozita se nacházejí hlavně v dermálních vláknech nebo elastických vláknech cévní stěny, což naznačuje cestu molekulární nukleace v těchto vláknech, která by měla být prozkoumána.

Tento strukturní a chemický popis je inovativní, ale neodpovídá na všechny otázky, které se kolem těchto vápenatých usazenin objevují: proč mají někteří pacienti, kteří vykazují normální rovnováhu fosfokalcia, masivní kožní kalcifikace? Proč naopak jiní pacienti, např. někteří dialyzovaní pacienti, vykazují extrémně narušené fosfokalcické bilance, ale žádnou kalcifikaci kůže? Tento paradox zvyšuje možnost existence "nukleačních ložisek" v elastických dermálních a vaskulárních vláknech, což u některých pacientů podporuje precipitaci fosfokalcických depozit. Některé in vitro modely zkoumaly tato nukleační ložiska v elastických vláknech. (ref Gourgas et al) Je pozoruhodné, že většině kalcifikujících dermatóz předchází kožní zánětlivý stav. Tyto kožní zánětlivé jevy mohou také vyvolat srážení vápenatých usazenin. Někteří autoři tak spekulují, že elastin je štěpen metaloproteinázou (MMP) v extracelulární matrix, čímž se vytvářejí nukleační ložiska zvýhodňující fosfokalcikové depozita. Munavalli a kol. prokázali zvýšení hladiny MMP ve vzorku moči pacienta s kalcifylaxí v kontextu rychlého úbytku hmotnosti (5). Předpokládají, že zvýšené hladiny MMP v séru u tohoto pacienta by mohly vést ke změně vnějšího elastického limitu a vaskulárním kalcifikacím. Tuto hypotézu podporují na druhé straně další modely alterace elastických vláken, např. při stárnutí kůže (dermatoporóza), kdy nedochází k zánětu a kalcifikace.

Základní hypotézou našeho projektu je, že zánět kůže vede ke specifické alteraci elastických vláken, což vede k jejich kalcifikaci.

Abychom prozkoumali tuto hypotézu, zejména během kalcifylaxe a PXE, navrhujeme použít multifotonovou mikroskopii, zobrazovací techniku ​​dostupnou v Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) na Ecole Polytechnique. Multifotonová mikroskopie byla vyvinuta na počátku 90. let jako alternativa ke konfokální mikroskopii, aby se zlepšilo hloubkové zobrazování biologických tkání se submikrometrickým rozlišením. A co je nejdůležitější, multifotonová mikroskopie může kombinovat několik žil kontrastu paralelně a bez jakéhokoli označení k identifikaci různých prvků tkáně. Signály druhé harmonické generace (SHG) umožňují specifické zobrazení nebarveného fibrilárního kolagenu s nesrovnatelnou citlivostí, zatímco dvoufotonová excitovaná fluorescence (2PEF) umožňuje buněčné zobrazení díky různým vnitřním buněčným chromoforům a také zobrazení elastinu v dermis nebo v jiných tkáních (viz. Obrázek 1) (6).

Multifotonová mikroskopie byla použita v několika studiích na kůži, včetně LOB (viz obrázek 1), které prokázaly vysokou relevanci této techniky pro strukturální charakterizaci dermálních vláken, zejména elastinových a kolagenových vláken, a jejich možné změny. Byl aplikován při studiu stárnutí kůže, stejně jako u patologií vedoucích k degeneraci elastických (PXE) nebo kolagenových vláken (Marfanův syndrom) (7-9). Tato technika je proto velmi vhodná pro zkoumání struktury elastických vláken při kožních zánětlivých jevech a kalcifikujících dermatózách.

Souběžně s tím bude kožní zánětlivý proces zkoumán jinými metodami. Imunohistochemie bude použita k detekci dermální MMP a rentgenová fluorescence (na Synchrotron Soleil, řada Diffabs) bude použita k průkazu intradermálních zinkových a jiných kovových usazenin, jak bylo provedeno v našich předchozích studiích (obrázek 2).

Obrázek 2: Rentgenová fluorescence kožní biopsie: příklad korelace mezi dermálním zánětlivým infiltrátem (A) a přítomností intradermálního zinku (B), zde během lichenoidní reakce na tetování (snímky zaznamenané na Soleil Synchrotron, Diffabs line, od S. Reguera, D. Bazina a H. Colboca).

Hlavním cílem našeho projektu je charakterizovat strukturální změny elastických vláken při kalcifikující dermatóze.

Sekundární cíle jsou:

• studovat důsledky kožních zánětlivých procesů na alteraci elastických vláken,
• k identifikaci možných nukleačních ložisek pro tvorbu fosfo-vápenatých depozit v elastických dermálních a vaskulárních vláknech.

Vzorky kůže. Studie bude prováděna především na lidské kůži, ale také na myším modelu myši PXE: ABCC6 KO. Přesněji řečeno, materiál studovaný na LOB bude:

• Biopsie lidské kůže již odebrané pro diagnostiku těchto kalcifikujících dermatóz: PXE, kalcifylaxe, jiné kalcifikující zánětlivé dermatózy (lupus panniculitis, dermatomyositis) z patologické laboratoře nemocnice Tenon (Dr Moguelet).
• Jako kontroly byly použity lidské biopsie zdravé kůže od pacientů různého věku (okraj odstranění kožního nádoru) z nemocnice Tenon. Zaměříme se na pacienty s pokročilým stárnutím kůže, zejména pacienty se solární elastózou. Tento model UV indukované alterace elastických vláken je skvělou kontrolou z hlediska nezánětlivého a nekalcifikovaného poškození elastických vláken.
• Kožní biopsie z myšího modelu PXE (ABCC6 KO myš) a z odpovídajících kontrolních myší z INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoly. Všechny tyto biopsie budou charakterizovány multifotonovou mikroskopií kombinací kontrastů 2PEF a SHG za účelem současného zobrazení elastických a kolagenových vláken. V prvním kroku bude experimentální protokol následující:

• Výroba několika sériových preparátů z každé biopsie v nemocnici Tenon: 1 nebarvené („bílé“) sklíčko pro multifotonové zobrazování, 1 sklíčko s obvyklým morfologickým barvením (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 sklíčko s barvením zvýrazňujícím usazeniny vápníku (Von Kossa ) a 3 sklíčka s imunohistochemickým značením hlavních MMP (protilátky proti MMP-1, 2 a 9).
• zobrazení na LOB na standardním optickém mikroskopu ve světlém poli (standardní a polarizované procházející světlo, fluorescence, DIC) všech obarvených preparátů přes velké zorné pole mozaikováním; identifikace oblastí zájmu (ROI) odpovídajících zánětlivým procesům, tkáňové remodelaci nebo minerálním depozitům. Všimněte si, že minerální usazeniny jsou odhaleny polarizovaným procházejícím světlem nebo fázovým kontrastem nebo DIC.
• Rentgenové fluorescenční zobrazování na Soleil Synchrotron k identifikaci kovových usazenin přítomných v biopsiích, zejména zinku. To bude provedeno ve spolupráci s Dominique Bazinem (Fyzikálně-chemický institut, CNRS, Paris-Saclay University), který má silné odborné znalosti v oblasti zobrazování minerálů v řadě Diffabs.
• Multifotonové zobrazování v LOB identifikovaných oblastí zájmu nebo dokonce ve velkém zorném poli automatickým sešíváním několika dlaždic. Snímky s rozlišením polarizace budou také prováděny ve velmi hustých oblastech nebo v remodelovaných oblastech, aby bylo možné zmapovat směr kolagenových a elastinových vláken (10).
• Automatizovaná kvantitativní analýza multifotonových LOB snímků pro měření několika parametrů souvisejících s množstvím a strukturou elastinu. Automatizované kvantitativní analýzy budou také prováděny na kolagenu a dalších strukturách zájmu pozorovaných na multifotonových snímcích nebo histologických snímcích. Výsledky různých zobrazovacích modalit budou korelovány na každé sérii preparátů. Všimněte si, že automatická analýza je nezbytná jak pro zamezení obvyklých zkreslení semikvantitativní analýzy, tak pro získání více informativních strukturálních parametrů. Z elastinových snímků budou například extrahovány následující parametry: střední hustota elastických vláken (na cm², v papilární dermis a v retikulární dermis), rozložení orientace elastických vláken, entropie a kruhový rozptyl tohoto rozdělení, stupeň zakřivení elastických vláken, jejich vzdálenost od minerálních ložisek.
• Statistická analýza multimodálních dat na základě vhodných statistických testů. Vzhledem k relativně malému počtu dostupných lidských vzorků budou použity a priori neparametrické testy (Wilcoxon-Mann-Whitney). Bude studováno minimálně 8 pacientů na skupinu, což by mělo být dostatečné vzhledem k přesnosti a reprodukovatelnosti automatizovaných měření. Pokud se u stejného pacienta provádí několik vzorků nebo sérií snímků, použijí se vnořené statistické testy (vnořené t-testy nebo vnořené Wilcoxonovy testy).

Ve druhém kroku a na základě výsledků prvního kroku budou různé položky tohoto protokolu vylepšeny, aby bylo možné získat více informací:

• Multifotonové zobrazování bude prováděno v biopsiích neporušené myší kůže, aby se lépe zvýraznila 3D organizace elastinu.
• Pokročilé fluorescenční zobrazování zánětu bude prováděno na myší kůži ex vivo pomocí spektrálních nebo FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) měření

• Třetí harmonická generace (THG) bude použita k vizualizaci struktury ložisek nerostů.

  1. Bazin D, a kol. Charakterizace a některé fyzikálně-chemické aspekty patologických mikrokalcifikací. Chem Rev. 10. října 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc a kol. Lokalizace, morfologické rysy a chemické složení kožních ložisek souvisejících s kalcifylaxí u pacientů s kalcifickou uremickou arteriolopatií. Dermatologie JAMA 2019.
  3. H Colboc a kol. Fyzikálně chemická charakterizace anorganických ložisek spojených s granulomy u kožní sarkoidózy. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2018.
  4. Haka AS a kol. Identifikace mikrokalcifikací v benigních a maligních lézích prsu sondováním rozdílů v jejich chemickém složení pomocí Ramanovy spektroskopie. Cancer Res. 15. září 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G a kol. Kalcifylaxe vyvolaná ztrátou hmotnosti: potenciální role matricových metaloproteináz. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. „Multifotonový obraz přírody a syntézy. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017): 21.-24.
  7. Wang, Hequn a kol. "Věkem související morfologické změny dermální matrice v lidské kůži dokumentované in vivo multifotonovou mikroskopií." Journal of biomedical optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z. a kol. "Kvantifikace morfologie aortálního a kožního elastinu a kolagenu u Marfanova syndromu pomocí multifotonové mikroskopie." Journal of strukturální biologie 187,3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P. L., a kol. "Kvantitativní přístup k histopatologické disekci poruch souvisejících s elastinem pomocí multifotonové mikroskopie." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire a M.-C. Schanne-Klein, "Monitorování dynamické reorganizace kolagenu během protahování kůže pomocí zobrazování SHG s rychlou polarizací." J. Biophoto. 12, e201800336 (2019).