Förändring av dermala elastiska fibrer under förkalkande dermatos: strukturell studie med multifotonmikroskopi (Calciphoton)

Mångfalden av patologier som åtföljs av mineralavlagringar i vävnader är stor (cancer, infektionsprocesser, miljösjukdomar) (1). Inom dermatologi är flera patologier associerade med kalciummineralavlagringar, såsom calciphylaxis och pseudoxanthoma elasticum (PXE). Hittills har få studier utförts på de kemiska egenskaperna hos kutana mineralavlagringar, deras fysiopatologiska konsekvenser, förekomsten av associerade patologier och deras återverkningar på mänskliga organ.

Detta har motiverat doktorsprojektet av Hester COLBOC, M.D., om karakterisering av kalciumavlagringar i olika förkalkande dermatoser, inklusive kalcifylax (2) och sarkoidos (3). Detta grundläggande forskningsprojekt genomförs inom ramen för ett samarbete mellan LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) och AP-HP, särskilt inom områdena uro-nefrologi (urinary lithiasis) och onkologi (4) (förkalkning i bröst- och sköldkörtelcancer). Vi har visat att hudförkalkningar består av karbapatit vid kalcifylax och kalcit vid sarkoidos. Vi har också visat att dessa avlagringar huvudsakligen är belägna i de elastiska fibrerna i huden eller kärlväggen, vilket tyder på att en molekylär kärnbildningsväg inom dessa fibrer ska utforskas.

Denna strukturella och kemiska beskrivning är innovativ, men svarar inte på alla frågor som uppstår kring dessa kalciumavlagringar: varför har vissa patienter, som uppvisar en normal fosfokalciumbalans, massiva hudförkalkninger? Varför uppvisar andra patienter, som vissa dialyspatienter, tvärtom extremt störda fosfokalciska balansräkningar, men ingen hudförkalkning? Denna paradox väcker möjligheten att förekomsten av "kärnbildningsfoci" i de elastiska dermala och vaskulära fibrerna, vilket gynnar utfällningen av fosfokalciska avlagringar hos vissa patienter. Vissa in vitro-modeller har utforskat dessa kärnbildningshärdar i elastiska fibrer. (ref Gourgas et al) Ganska anmärkningsvärt föregås de flesta förkalkande dermatoser av ett kutant inflammatoriskt tillstånd. Dessa hudinflammatoriska fenomen kan också inducera utfällning av kalciumavlagringar. Vissa författare spekulerar således att elastin spjälkas av metalloproteinas (MMP) i den extracellulära matrisen, vilket skapar kärnbildningsfoci som gynnar fosfokalciska avlagringar. Munavalli et al. visade en ökad nivå av MMP i urinprov från en patient med kalcifylax i ett sammanhang med snabb viktminskning (5). De antar att förhöjda MMP-nivåer i serum hos denna patient kan leda till en förändring av den yttre elastiska gränsen och vaskulära förkalkningar. Denna hypotes stöds å andra sidan av andra modeller för förändring av elastiska fibrer, såsom under hudens åldrande (dermatoporos), där det inte finns någon inflammation och ingen förkalkning.

Bakgrundshypotesen för vårt projekt är att hudinflammation leder till en specifik förändring av de elastiska fibrerna, vilket bidrar till deras förkalkning.

För att utforska denna hypotes, särskilt under kalcifylax och PXE, föreslår vi att använda multifotonmikroskopi, en avbildningsteknik tillgänglig vid Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) vid Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi har utvecklats i början av 1990-talet som ett alternativ till konfokalmikroskopi, för att förbättra djupgående avbildning av biologiska vävnader med submikrometrisk upplösning. Det viktigaste är att multifotonmikroskopi kan kombinera flera kontraster parallellt och utan någon märkning för att identifiera de olika elementen i en vävnad. Second harmonic generation (SHG)-signaler tillåter specifik avbildning av ofärgat fibrillärt kollagen med oöverträffad känslighet, medan tvåfotonexciterad fluorescens (2PEF) tillåter cellulär avbildning tack vare olika inre cellulära kromoforer samt elastinavbildning i dermis eller i andra vävnader (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi har använts i flera studier på huden, inklusive vid LOB (se figur 1), som har visat den höga relevansen av denna teknik för strukturell karaktärisering av dermala fibrer, särskilt elastin- och kollagenfibrer, och deras möjliga förändring. Det har använts för att studera hudens åldrande, såväl som på patologier som leder till degeneration av elastiska (PXE) eller kollagenfibrer (Marfans syndrom) (7-9). Denna teknik är därför mycket lämplig för att utforska strukturen av elastiska fibrer under kutana inflammatoriska fenomen och förkalkande dermatoser.

Parallellt kommer den kutana inflammatoriska processen att utforskas med andra metoder. Immunhistokemi kommer att användas för att detektera dermal MMP och röntgenfluorescens (vid Synchrotron Soleil, Diffabs linje) kommer att användas för att bevisa intradermala zink- och andra metallavlagringar, som gjorts i våra tidigare studier (Figur 2).

Figur 2: Röntgenfluorescens av en hudbiopsi: exempel på korrelation mellan dermalt inflammatoriskt infiltrat (A) och närvaron av intradermalt zink (B), här under en lichenoid reaktion på tatuering (bilder inspelade vid Soleil Synchrotron, Diffabs linje, av S. Reguer, D. Bazin och H. Colboc).

Huvudsyftet med vårt projekt är att karakterisera de strukturella förändringarna av elastiska fibrer under förkalkningsdermatos.

De sekundära målen är:

• att studera konsekvenserna av kutana inflammatoriska processer på förändringen av elastiska fibrer,
• att identifiera en möjlig kärnbildningsfoci för bildandet av fosfo-kalciumavlagringar i de elastiska dermala och vaskulära fibrerna.

Hudprover. Studien kommer huvudsakligen att utföras på mänsklig hud, men även på en musmodell av PXE: ABCC6 KO-mus. Mer exakt kommer materialet som studeras vid LOB att vara:

• Human hudbiopsier som redan samlats in för diagnos av dessa förkalkande dermatoser: PXE, kalcifylax, andra förkalkande inflammatoriska dermatoser (lupus pannikulit, dermatomyosit), från patologilaboratoriet på Tenonsjukhuset (Dr Moguelet).
• Som kontroller, humana biopsier av frisk hud från patienter i olika åldrar, (marginal för borttagning av hudtumör), från Tenon Hospital. Vi kommer att fokusera på patienter med avancerat hudåldrande, särskilt patienter med solelastos. Denna modell av UV-inducerad förändring av elastiska fibrer är en bra kontroll när det gäller icke-inflammatoriska och icke-förkalkade elastiska fibrer.
• Kutana biopsier från musmodellen av PXE (ABCC6 KO-mus) och från matchade kontrollmöss, från INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoll. Alla dessa biopsier kommer att karakteriseras av multifotonmikroskopi genom att kombinera 2PEF och SHG kontraster för att samtidigt avbilda elastiska och kollagenfibrer. I ett första steg kommer det experimentella protokollet att vara följande:

• Tillverkning på Tenon Hospital av flera seriella objektglas från varje biopsi: 1 ofärgade ("vit") objektglas för multifotonavbildning, 1 objektglas med vanlig morfologisk färgning (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglas med färgning som framhäver kalciumavlagringar (Von Kossa) ) och 3 objektglas med immunhistokemiska märkningar av de viktigaste MMP:erna (antikroppar mot MMP-1, 2 och 9).
• avbildning vid LOB på ett optiskt standardmikroskop med ljusfält (standard och polariserat transmitterat ljus, fluorescens, DIC) av alla de färgade objektglasen över ett stort synfält genom mosaik; identifiering av regioner av intresse (ROI) som motsvarar inflammatoriska processer, vävnadsremodellering eller mineralavlagringar. Observera att mineralavlagringar avslöjas av polariserat transmitterat ljus eller av faskontrast eller DIC.
• Röntgenfluorescensavbildning vid Soleil Synchrotron för att identifiera de metalliska avlagringarna som finns i biopsierna, speciellt zink. Detta kommer att ske i samarbete med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en stark expertis inom mineralavbildning inom Diffabs-linjen.
• Multifotonavbildning vid LOB av de identifierade områdena av intresse, eller till och med på ett stort synfält genom att automatiskt sy flera brickor. Polarisationsupplösta bilder kommer också att utföras i mycket täta områden eller i ombyggda områden för att kartlägga kollagen- och elastinfibrernas riktning (10).
• Automatiserad kvantitativ analys av multifoton LOB-bilder för att mäta flera parametrar relaterade till mängden och strukturen av elastin. Automatiserade kvantitativa analyser kommer också att utföras på kollagen och andra strukturer av intresse observerade på multifotonbilder eller histologiska bilder. Resultaten av de olika avbildningsmodaliteterna kommer att korreleras på varje serie av bilder. Observera att automatisk analys är väsentlig både för att undvika de vanliga fördomarna i semikvantitativ analys och för att få mer informativa strukturella parametrar. Till exempel kommer följande parametrar att extraheras från elastinbilderna: medeldensiteten för de elastiska fibrerna (per cm², i den papillära dermis och i den retikulära dermis), orienteringsfördelningen av de elastiska fibrerna, entropin och den cirkulära variansen av denna fördelning, graden av krökning av de elastiska fibrerna, deras avstånd från mineralavlagringarna.
• Statistisk analys av multimodala data, baserad på lämpliga statistiska tester. A priori icke-parametriska tester (Wilcoxon-Mann-Whitney) kommer att användas med tanke på det relativt lilla antalet tillgängliga mänskliga prover. Minst 8 patienter per grupp kommer att studeras, vilket borde vara tillräckligt på grund av de automatiserade mätningarnas noggrannhet och reproducerbarhet. Om flera prover eller bildserier utförs på samma patient kommer kapslade statistiska tester att användas (kapslade t-tester eller kapslade Wilcoxon).

I ett andra steg och baserat på resultaten från det första steget kommer olika punkter i detta protokoll att förbättras för att få tillgång till mer information:

• Multifotonavbildning kommer att utföras i intakta murina hudbiopsier för att bättre markera 3D-organisationen av elastin.
• Avancerad fluorescensavbildning av inflammation kommer att utföras i ex vivo murin hud, med hjälp av spektral- eller FLIM-mätningar (fluorescenslivstidsavbildningsmikroskopi)

• Third Harmonic Generation (THG) kommer att användas för att visualisera strukturen på mineralfyndigheterna.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering och några fysikalisk-kemiska aspekter av patologiska mikroförkalkningar. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.

Mångfalden av patologier som åtföljs av mineralavlagringar i vävnader är stor (cancer, infektionsprocesser, miljösjukdomar) (1). Inom dermatologi är flera patologier associerade med kalciummineralavlagringar, såsom calciphylaxis och pseudoxanthoma elasticum (PXE). Hittills har få studier utförts på de kemiska egenskaperna hos kutana mineralavlagringar, deras fysiopatologiska konsekvenser, förekomsten av associerade patologier och deras återverkningar på mänskliga organ.

Detta har motiverat doktorsprojektet av Hester COLBOC, M.D., om karakterisering av kalciumavlagringar i olika förkalkande dermatoser, inklusive kalcifylax (2) och sarkoidos (3). Detta grundläggande forskningsprojekt genomförs inom ramen för ett samarbete mellan LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) och AP-HP, särskilt inom områdena uro-nefrologi (urinary lithiasis) och onkologi (4) (förkalkning i bröst- och sköldkörtelcancer). Vi har visat att hudförkalkningar består av karbapatit vid kalcifylax och kalcit vid sarkoidos. Vi har också visat att dessa avlagringar huvudsakligen är belägna i de elastiska fibrerna i huden eller kärlväggen, vilket tyder på att en molekylär kärnbildningsväg inom dessa fibrer ska utforskas.

Denna strukturella och kemiska beskrivning är innovativ, men svarar inte på alla frågor som uppstår kring dessa kalciumavlagringar: varför har vissa patienter, som uppvisar en normal fosfokalciumbalans, massiva hudförkalkninger? Varför uppvisar andra patienter, som vissa dialyspatienter, tvärtom extremt störda fosfokalciska balansräkningar, men ingen hudförkalkning? Denna paradox väcker möjligheten att förekomsten av "kärnbildningsfoci" i de elastiska dermala och vaskulära fibrerna, vilket gynnar utfällningen av fosfokalciska avlagringar hos vissa patienter. Vissa in vitro-modeller har utforskat dessa kärnbildningshärdar i elastiska fibrer. (ref Gourgas et al) Ganska anmärkningsvärt föregås de flesta förkalkande dermatoser av ett kutant inflammatoriskt tillstånd. Dessa hudinflammatoriska fenomen kan också inducera utfällning av kalciumavlagringar. Vissa författare spekulerar således att elastin spjälkas av metalloproteinas (MMP) i den extracellulära matrisen, vilket skapar kärnbildningsfoci som gynnar fosfokalciska avlagringar. Munavalli et al. visade en ökad nivå av MMP i urinprov från en patient med kalcifylax i ett sammanhang med snabb viktminskning (5). De antar att förhöjda MMP-nivåer i serum hos denna patient kan leda till en förändring av den yttre elastiska gränsen och vaskulära förkalkningar. Denna hypotes stöds å andra sidan av andra modeller för förändring av elastiska fibrer, såsom under hudens åldrande (dermatoporos), där det inte finns någon inflammation och ingen förkalkning.

Bakgrundshypotesen för vårt projekt är att hudinflammation leder till en specifik förändring av de elastiska fibrerna, vilket bidrar till deras förkalkning.

För att utforska denna hypotes, särskilt under kalcifylax och PXE, föreslår vi att använda multifotonmikroskopi, en avbildningsteknik tillgänglig vid Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) vid Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi har utvecklats i början av 1990-talet som ett alternativ till konfokalmikroskopi, för att förbättra djupgående avbildning av biologiska vävnader med submikrometrisk upplösning. Det viktigaste är att multifotonmikroskopi kan kombinera flera kontraster parallellt och utan någon märkning för att identifiera de olika elementen i en vävnad. Second harmonic generation (SHG)-signaler tillåter specifik avbildning av ofärgat fibrillärt kollagen med oöverträffad känslighet, medan tvåfotonexciterad fluorescens (2PEF) tillåter cellulär avbildning tack vare olika inre cellulära kromoforer samt elastinavbildning i dermis eller i andra vävnader (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi har använts i flera studier på huden, inklusive vid LOB (se figur 1), som har visat den höga relevansen av denna teknik för strukturell karaktärisering av dermala fibrer, särskilt elastin- och kollagenfibrer, och deras möjliga förändring. Det har använts för att studera hudens åldrande, såväl som på patologier som leder till degeneration av elastiska (PXE) eller kollagenfibrer (Marfans syndrom) (7-9). Denna teknik är därför mycket lämplig för att utforska strukturen av elastiska fibrer under kutana inflammatoriska fenomen och förkalkande dermatoser.

Parallellt kommer den kutana inflammatoriska processen att utforskas med andra metoder. Immunhistokemi kommer att användas för att detektera dermal MMP och röntgenfluorescens (vid Synchrotron Soleil, Diffabs linje) kommer att användas för att bevisa intradermala zink- och andra metallavlagringar, som gjorts i våra tidigare studier (Figur 2).

Figur 2: Röntgenfluorescens av en hudbiopsi: exempel på korrelation mellan dermalt inflammatoriskt infiltrat (A) och närvaron av intradermalt zink (B), här under en lichenoid reaktion på tatuering (bilder inspelade vid Soleil Synchrotron, Diffabs linje, av S. Reguer, D. Bazin och H. Colboc).

Huvudsyftet med vårt projekt är att karakterisera de strukturella förändringarna av elastiska fibrer under förkalkningsdermatos.

De sekundära målen är:

• att studera konsekvenserna av kutana inflammatoriska processer på förändringen av elastiska fibrer,
• att identifiera en möjlig kärnbildningsfoci för bildandet av fosfo-kalciumavlagringar i de elastiska dermala och vaskulära fibrerna.

Hudprover. Studien kommer huvudsakligen att utföras på mänsklig hud, men även på en musmodell av PXE: ABCC6 KO-mus. Mer exakt kommer materialet som studeras vid LOB att vara:

• Human hudbiopsier som redan samlats in för diagnos av dessa förkalkande dermatoser: PXE, kalcifylax, andra förkalkande inflammatoriska dermatoser (lupus pannikulit, dermatomyosit), från patologilaboratoriet på Tenonsjukhuset (Dr Moguelet).
• Som kontroller, humana biopsier av frisk hud från patienter i olika åldrar, (marginal för borttagning av hudtumör), från Tenon Hospital. Vi kommer att fokusera på patienter med avancerat hudåldrande, särskilt patienter med solelastos. Denna modell av UV-inducerad förändring av elastiska fibrer är en bra kontroll när det gäller icke-inflammatoriska och icke-förkalkade elastiska fibrer.
• Kutana biopsier från musmodellen av PXE (ABCC6 KO-mus) och från matchade kontrollmöss, från INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoll. Alla dessa biopsier kommer att karakteriseras av multifotonmikroskopi genom att kombinera 2PEF och SHG kontraster för att samtidigt avbilda elastiska och kollagenfibrer. I ett första steg kommer det experimentella protokollet att vara följande:

• Tillverkning på Tenon Hospital av flera seriella objektglas från varje biopsi: 1 ofärgade ("vit") objektglas för multifotonavbildning, 1 objektglas med vanlig morfologisk färgning (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglas med färgning som framhäver kalciumavlagringar (Von Kossa) ) och 3 objektglas med immunhistokemiska märkningar av de viktigaste MMP:erna (antikroppar mot MMP-1, 2 och 9).
• avbildning vid LOB på ett optiskt standardmikroskop med ljusfält (standard och polariserat transmitterat ljus, fluorescens, DIC) av alla de färgade objektglasen över ett stort synfält genom mosaik; identifiering av regioner av intresse (ROI) som motsvarar inflammatoriska processer, vävnadsremodellering eller mineralavlagringar. Observera att mineralavlagringar avslöjas av polariserat transmitterat ljus eller av faskontrast eller DIC.
• Röntgenfluorescensavbildning vid Soleil Synchrotron för att identifiera de metalliska avlagringarna som finns i biopsierna, speciellt zink. Detta kommer att ske i samarbete med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en stark expertis inom mineralavbildning inom Diffabs-linjen.
• Multifotonavbildning vid LOB av de identifierade områdena av intresse, eller till och med på ett stort synfält genom att automatiskt sy flera brickor. Polarisationsupplösta bilder kommer också att utföras i mycket täta områden eller i ombyggda områden för att kartlägga kollagen- och elastinfibrernas riktning (10).
• Automatiserad kvantitativ analys av multifoton LOB-bilder för att mäta flera parametrar relaterade till mängden och strukturen av elastin. Automatiserade kvantitativa analyser kommer också att utföras på kollagen och andra strukturer av intresse observerade på multifotonbilder eller histologiska bilder. Resultaten av de olika avbildningsmodaliteterna kommer att korreleras på varje serie av bilder. Observera att automatisk analys är väsentlig både för att undvika de vanliga fördomarna i semikvantitativ analys och för att få mer informativa strukturella parametrar. Till exempel kommer följande parametrar att extraheras från elastinbilderna: medeldensiteten för de elastiska fibrerna (per cm², i den papillära dermis och i den retikulära dermis), orienteringsfördelningen av de elastiska fibrerna, entropin och den cirkulära variansen av denna fördelning, graden av krökning av de elastiska fibrerna, deras avstånd från mineralavlagringarna.
• Statistisk analys av multimodala data, baserad på lämpliga statistiska tester. A priori icke-parametriska tester (Wilcoxon-Mann-Whitney) kommer att användas med tanke på det relativt lilla antalet tillgängliga mänskliga prover. Minst 8 patienter per grupp kommer att studeras, vilket borde vara tillräckligt på grund av de automatiserade mätningarnas noggrannhet och reproducerbarhet. Om flera prover eller bildserier utförs på samma patient kommer kapslade statistiska tester att användas (kapslade t-tester eller kapslade Wilcoxon).

I ett andra steg och baserat på resultaten från det första steget kommer olika punkter i detta protokoll att förbättras för att få tillgång till mer information:

• Multifotonavbildning kommer att utföras i intakta murina hudbiopsier för att bättre markera 3D-organisationen av elastin.
• Avancerad fluorescensavbildning av inflammation kommer att utföras i ex vivo murin hud, med hjälp av spektral- eller FLIM-mätningar (fluorescenslivstidsavbildningsmikroskopi)

• Third Harmonic Generation (THG) kommer att användas för att visualisera strukturen på mineralfyndigheterna.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering och några fysikalisk-kemiska aspekter av patologiska mikroförkalkningar. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Lokalisering, morfologiska egenskaper och kemisk sammansättning av kalcifylaxrelaterade hudavlagringar hos patienter med kalcifik uremisk arteriolopati. JAMA Dermatology 2019.
  3. H Colboc, et al. Fysikalisk-kemisk karakterisering av oorganiska avlagringar associerade med granulom vid kutan sarkoidos. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2018.
  4. Haka AS, et al. Identifiera mikrokalcifikationer i benigna och maligna bröstskador genom att undersöka skillnader i deras kemiska sammansättning med hjälp av Raman-spektroskopi. Cancer Res. 15 sept 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Viktminskningsinducerad kalcifylax: potentiell roll för matrismetalloproteinaser. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Åldersrelaterade morfologiska förändringar av dermal matris i mänsklig hud dokumenterade in vivo med multifotonmikroskopi." Journal of biomedical optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Kvantifiering av aorta och kutan elastin och kollagenmorfologi i Marfans syndrom genom multifotonmikroskopi." Journal of structural biology 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "En kvantitativ metod för histopatologisk dissektion av elastinrelaterade störningar med hjälp av multifotonmikroskopi." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire och M.-C. Schanne-Klein, "Övervaka dynamisk kollagenomorganisation under hudsträckning med snabb polarisationsupplöst SHG-avbildning." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).