Ændring af dermale elastiske fibre under forkalkning dermatose: Strukturel undersøgelse ved hjælp af multifotonmikroskopi (Calciphoton)

Variationen af ​​patologier ledsaget af mineralaflejringer i væv er stor (kræft, infektionsprocesser, miljøsygdomme) (1). I dermatologi er flere patologier forbundet med calciummineralaflejringer, såsom calciphylaxis og pseudoxanthoma elasticum (PXE). Til dato er der kun udført få undersøgelser af de kemiske egenskaber af kutane mineralaflejringer, deres fysiopatologiske konsekvenser, forekomsten af ​​associerede patologier og deres konsekvenser for menneskelige organer.

Dette har motiveret ph.d.-projektet af Hester COLBOC, M.D., om karakterisering af calciumaflejringer i forskellige calcificerende dermatose, herunder calciphylaxis (2) og sarkoidose (3). Dette grundlæggende forskningsprojekt udføres inden for rammerne af et samarbejde mellem LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) og AP-HP, især inden for områderne uro-nephrology (urinary lithiasis) og onkologi (4) (forkalkninger i bryst- og skjoldbruskkirtelkræft). Vi har vist, at hudforkalkninger består af carbapatit ved calciphylakse og calcit ved sarkoidose. Vi har også vist, at disse aflejringer hovedsageligt er placeret i de dermale eller karvægs elastiske fibre, hvilket tyder på, at en molekylær nukleationsvej inden for disse fibre skal undersøges.

Denne strukturelle og kemiske beskrivelse er nyskabende, men besvarer ikke alle de spørgsmål, der opstår omkring disse calciumaflejringer: hvorfor har nogle patienter, som har en normal phosphocalciumbalance, massive hudforkalkninger? Hvorfor har andre patienter, såsom nogle dialysepatienter, tværtimod ekstremt forstyrrede fosfokalciske balancer, men ingen hudforkalkning? Dette paradoks rejser muligheden for eksistensen af ​​"kernedannelsesfoci" i de elastiske dermale og vaskulære fibre, hvilket fremmer udfældningen af ​​phosphocalciske aflejringer hos nogle patienter. Nogle in vitro-modeller har udforsket disse nukleationsfoci i elastiske fibre. (ref Gourgas et al) Ganske bemærkelsesværdigt er de fleste forkalkende dermatose forudgået af en kutan inflammatorisk tilstand. Disse hudinflammatoriske fænomener kan også fremkalde udfældning af calciumaflejringer. Nogle forfattere spekulerer således på, at elastin fordøjes af metalloproteinase (MMP) i den ekstracellulære matrix, hvilket skaber nukleationsfoci, der favoriserer phosphocalcic aflejringer. Munavalli et al. viste et stigningsniveau af MMP i urinprøve fra en patient med calciphylaxis i en sammenhæng med hurtigt vægttab (5). De antager, at forhøjede MMP-niveauer i serum hos denne patient kan føre til en ændring af den ydre elastiske grænse og vaskulære forkalkninger. Denne hypotese understøttes på den anden side af andre modeller for ændring af elastiske fibre, såsom under hudens aldring (dermatoporose), hvor der ikke er nogen betændelse og ingen forkalkning.

Baggrundshypotesen for vores projekt er, at hudbetændelse fører til en specifik ændring af de elastiske fibre, hvilket er befordrende for deres forkalkning.

For at udforske denne hypotese, især under calciphylaxis og PXE, foreslår vi at bruge multifotonmikroskopi, en billedbehandlingsteknik tilgængelig på Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) ved Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi er blevet udviklet i begyndelsen af ​​1990'erne som et alternativ til konfokal mikroskopi for at forbedre dybdegående billeddannelse af biologiske væv med submikrometrisk opløsning. Vigtigst af alt kan multifotonmikroskopi kombinere adskillige kontrastmængder parallelt og uden nogen mærkning for at identificere de forskellige elementer i et væv. Second harmonic generation (SHG)-signaler muliggør specifik billeddannelse af ufarvet fibrillært kollagen med uovertruffen følsomhed, mens to-foton-exciteret fluorescens (2PEF) muliggør cellulær billeddannelse takket være forskellige iboende cellulære kromoforer samt elastin-billeddannelse i dermis eller i andre væv (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi er blevet brugt i adskillige undersøgelser af huden, herunder ved LOB (se figur 1), som har bevist den høje relevans af denne teknik for strukturel karakterisering af dermale fibre, især elastin- og kollagenfibre, og deres mulige ændring. Det er blevet anvendt til undersøgelse af hudens aldring, såvel som på patologier, der fører til degeneration af elastiske (PXE) eller kollagenfibre (Marfan Syndrom) (7-9). Denne teknik er derfor yderst velegnet til at udforske strukturen af ​​elastiske fibre under kutane inflammatoriske fænomener og forkalkende dermatoser.

Parallelt hermed vil den kutane inflammatoriske proces blive udforsket med andre metoder. Immunhistokemi vil blive brugt til at detektere dermal MMP og røntgenfluorescens (ved Synchrotron Soleil, Diffabs linje) vil blive brugt til at bevise intradermale zink og andre metalliske aflejringer, som gjort i vores tidligere undersøgelser (figur 2).

Figur 2: Røntgenfluorescens af en hudbiopsi: eksempel på korrelation mellem dermalt inflammatorisk infiltrat (A) og tilstedeværelsen af ​​intradermalt zink (B), her under en lichenoid reaktion på tatovering (billeder optaget ved Soleil Synchrotron, Diffabs-linjen, af S. Reguer, D. Bazin og H. Colboc).

Hovedformålet med vores projekt er at karakterisere de strukturelle ændringer af elastiske fibre under calcificerende dermatose.

De sekundære mål er:

• at studere konsekvenserne af kutane inflammatoriske processer på ændringen af ​​elastiske fibre,
• at identificere et muligt nukleationsfoci for dannelsen af ​​phospho-calciumaflejringer i de elastiske dermale og vaskulære fibre.

Hudprøver. Undersøgelsen vil primært blive udført på menneskelig hud, men også på en musemodel af PXE: ABCC6 KO mus. Mere præcist vil materialet studeret på LOB være:

• Humane hudbiopsier, der allerede er indsamlet til diagnosticering af disse forkalkende dermatoser: PXE, calciphylaxis, andre forkalkende inflammatoriske dermatoser (lupus panniculitis, dermatomyositis), fra patologilaboratoriet på Tenon-hospitalet (Dr. Moguelet).
• Som kontroller, humane biopsier af sund hud fra patienter i forskellige aldre, (margin for hudtumorfjernelse), fra Tenon Hospital. Vi vil fokusere på patienter med fremskreden hudældning, især patienter med solelastose. Denne model af UV-induceret ændring af elastiske fibre er en stor kontrol med hensyn til ikke-inflammatoriske og ikke-kalcificerede elastiske fibre skader.
• Kutane biopsier fra musemodellen af ​​PXE (ABCC6 KO-mus) og fra matchede kontrolmus, fra INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoller. Alle disse biopsier vil blive karakteriseret ved multifotonmikroskopi ved at kombinere 2PEF og SHG kontraster for samtidig at afbilde elastiske og kollagenfibre. I et første trin vil den eksperimentelle protokol være som følger:

• Produktion på Tenon Hospital af flere serieglas fra hver biopsi: 1 ufarvet ("hvid") objektglas til multifoton-billeddannelse, 1 objektglas med sædvanlig morfologisk farvning (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglas med farvning, der fremhæver calciumaflejringer (Von Kossa) ) og 3 objektglas med immunhistokemiske mærkninger af de vigtigste MMP'er (antistoffer mod MMP-1, 2 og 9).
• billeddannelse ved LOB på et standard optisk lysfeltsmikroskop (standard og polariseret transmitteret lys, fluorescens, DIC) af alle de farvede objektglas over et stort synsfelt ved mosaik; identifikation af regioner af interesse (ROI) svarende til inflammatoriske processer, vævsremodellering eller mineralaflejringer. Bemærk, at mineralaflejringer afsløres af polariseret transmitteret lys eller ved fasekontrast eller DIC.
• Røntgenfluorescensbilleddannelse ved Soleil Synchrotron for at identificere de metalliske aflejringer, der er til stede i biopsierne, især zink. Dette vil ske i samarbejde med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en stærk ekspertise inden for mineralsk billeddannelse i Diffabs-linjen.
• Multifoton-billeddannelse ved LOB af de identificerede områder af interesse, eller endda på et stort synsfelt ved automatisk at sy flere fliser. Polarisationsopløste billeder vil også blive udført i meget tætte områder eller i ombyggede områder for at kortlægge retningen af ​​kollagen- og elastinfibre (10).
• Automatiseret kvantitativ analyse af multifoton LOB-billeder for at måle flere parametre relateret til mængden og strukturen af ​​elastin. Automatiserede kvantitative analyser vil også blive udført på kollagen og andre strukturer af interesse observeret på multifotonbilleder eller histologiske billeder. Resultaterne af de forskellige billeddannelsesmodaliteter vil blive korreleret på hver serie af dias. Bemærk, at automatisk analyse er afgørende både for at undgå de sædvanlige skævheder ved semi-kvantitativ analyse og for at opnå mere informative strukturelle parametre. For eksempel vil følgende parametre blive ekstraheret fra elastinbillederne: den gennemsnitlige tæthed af de elastiske fibre (pr. cm², i den papillære dermis og i den retikulære dermis), orienteringsfordelingen af ​​de elastiske fibre, entropien og den cirkulære varians af denne fordeling, graden af ​​krumning af de elastiske fibre, deres afstand fra mineralaflejringerne.
• Statistisk analyse af multimodale data baseret på passende statistiske tests. A priori ikke-parametriske tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) vil blive brugt i lyset af det relativt lille antal tilgængelige humane prøver. Der vil blive undersøgt minimum 8 patienter pr. gruppe, hvilket burde være tilstrækkeligt på grund af nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​de automatiserede målinger. Hvis der udføres flere prøver eller billedserier på den samme patient, vil indlejrede statistiske tests blive brugt (indlejrede t-tests eller indlejrede Wilcoxon).

I et andet trin og baseret på resultaterne af det første trin, vil forskellige elementer i denne protokol blive forbedret for at få adgang til flere oplysninger:

• Multifoton-billeddannelse vil blive udført i intakte murine hudbiopsier for bedre at fremhæve 3D-organiseringen af ​​elastin.
• Avanceret fluorescensbilleddannelse af inflammation vil blive udført i ex vivo murin hud ved hjælp af spektral- eller FLIM-målinger (fluorescens-lifetime imaging microscopy)

• Third Harmonic Generation (THG) vil blive brugt til at visualisere strukturen af ​​mineralforekomsterne.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering og nogle fysisk-kemiske aspekter af patologiske mikrokalcifikationer. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.

Variationen af ​​patologier ledsaget af mineralaflejringer i væv er stor (kræft, infektionsprocesser, miljøsygdomme) (1). I dermatologi er flere patologier forbundet med calciummineralaflejringer, såsom calciphylaxis og pseudoxanthoma elasticum (PXE). Til dato er der kun udført få undersøgelser af de kemiske egenskaber af kutane mineralaflejringer, deres fysiopatologiske konsekvenser, forekomsten af ​​associerede patologier og deres konsekvenser for menneskelige organer.

Dette har motiveret ph.d.-projektet af Hester COLBOC, M.D., om karakterisering af calciumaflejringer i forskellige calcificerende dermatose, herunder calciphylaxis (2) og sarkoidose (3). Dette grundlæggende forskningsprojekt udføres inden for rammerne af et samarbejde mellem LCP (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University) og AP-HP, især inden for områderne uro-nephrology (urinary lithiasis) og onkologi (4) (forkalkninger i bryst- og skjoldbruskkirtelkræft). Vi har vist, at hudforkalkninger består af carbapatit ved calciphylakse og calcit ved sarkoidose. Vi har også vist, at disse aflejringer hovedsageligt er placeret i de dermale eller karvægs elastiske fibre, hvilket tyder på, at en molekylær nukleationsvej inden for disse fibre skal undersøges.

Denne strukturelle og kemiske beskrivelse er nyskabende, men besvarer ikke alle de spørgsmål, der opstår omkring disse calciumaflejringer: hvorfor har nogle patienter, som har en normal phosphocalciumbalance, massive hudforkalkninger? Hvorfor har andre patienter, såsom nogle dialysepatienter, tværtimod ekstremt forstyrrede fosfokalciske balancer, men ingen hudforkalkning? Dette paradoks rejser muligheden for eksistensen af ​​"kernedannelsesfoci" i de elastiske dermale og vaskulære fibre, hvilket fremmer udfældningen af ​​phosphocalciske aflejringer hos nogle patienter. Nogle in vitro-modeller har udforsket disse nukleationsfoci i elastiske fibre. (ref Gourgas et al) Ganske bemærkelsesværdigt er de fleste forkalkende dermatose forudgået af en kutan inflammatorisk tilstand. Disse hudinflammatoriske fænomener kan også fremkalde udfældning af calciumaflejringer. Nogle forfattere spekulerer således på, at elastin fordøjes af metalloproteinase (MMP) i den ekstracellulære matrix, hvilket skaber nukleationsfoci, der favoriserer phosphocalcic aflejringer. Munavalli et al. viste et stigningsniveau af MMP i urinprøve fra en patient med calciphylaxis i en sammenhæng med hurtigt vægttab (5). De antager, at forhøjede MMP-niveauer i serum hos denne patient kan føre til en ændring af den ydre elastiske grænse og vaskulære forkalkninger. Denne hypotese understøttes på den anden side af andre modeller for ændring af elastiske fibre, såsom under hudens aldring (dermatoporose), hvor der ikke er nogen betændelse og ingen forkalkning.

Baggrundshypotesen for vores projekt er, at hudbetændelse fører til en specifik ændring af de elastiske fibre, hvilket er befordrende for deres forkalkning.

For at udforske denne hypotese, især under calciphylaxis og PXE, foreslår vi at bruge multifotonmikroskopi, en billedbehandlingsteknik tilgængelig på Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) ved Ecole Polytechnique. Multifotonmikroskopi er blevet udviklet i begyndelsen af ​​1990'erne som et alternativ til konfokal mikroskopi for at forbedre dybdegående billeddannelse af biologiske væv med submikrometrisk opløsning. Vigtigst af alt kan multifotonmikroskopi kombinere adskillige kontrastmængder parallelt og uden nogen mærkning for at identificere de forskellige elementer i et væv. Second harmonic generation (SHG)-signaler muliggør specifik billeddannelse af ufarvet fibrillært kollagen med uovertruffen følsomhed, mens to-foton-exciteret fluorescens (2PEF) muliggør cellulær billeddannelse takket være forskellige iboende cellulære kromoforer samt elastin-billeddannelse i dermis eller i andre væv (se Figur 1) (6).

Multifotonmikroskopi er blevet brugt i adskillige undersøgelser af huden, herunder ved LOB (se figur 1), som har bevist den høje relevans af denne teknik for strukturel karakterisering af dermale fibre, især elastin- og kollagenfibre, og deres mulige ændring. Det er blevet anvendt til undersøgelse af hudens aldring, såvel som på patologier, der fører til degeneration af elastiske (PXE) eller kollagenfibre (Marfan Syndrom) (7-9). Denne teknik er derfor yderst velegnet til at udforske strukturen af ​​elastiske fibre under kutane inflammatoriske fænomener og forkalkende dermatoser.

Parallelt hermed vil den kutane inflammatoriske proces blive udforsket med andre metoder. Immunhistokemi vil blive brugt til at detektere dermal MMP og røntgenfluorescens (ved Synchrotron Soleil, Diffabs linje) vil blive brugt til at bevise intradermale zink og andre metalliske aflejringer, som gjort i vores tidligere undersøgelser (figur 2).

Figur 2: Røntgenfluorescens af en hudbiopsi: eksempel på korrelation mellem dermalt inflammatorisk infiltrat (A) og tilstedeværelsen af ​​intradermalt zink (B), her under en lichenoid reaktion på tatovering (billeder optaget ved Soleil Synchrotron, Diffabs-linjen, af S. Reguer, D. Bazin og H. Colboc).

Hovedformålet med vores projekt er at karakterisere de strukturelle ændringer af elastiske fibre under calcificerende dermatose.

De sekundære mål er:

• at studere konsekvenserne af kutane inflammatoriske processer på ændringen af ​​elastiske fibre,
• at identificere et muligt nukleationsfoci for dannelsen af ​​phospho-calciumaflejringer i de elastiske dermale og vaskulære fibre.

Hudprøver. Undersøgelsen vil primært blive udført på menneskelig hud, men også på en musemodel af PXE: ABCC6 KO mus. Mere præcist vil materialet studeret på LOB være:

• Humane hudbiopsier, der allerede er indsamlet til diagnosticering af disse forkalkende dermatoser: PXE, calciphylaxis, andre forkalkende inflammatoriske dermatoser (lupus panniculitis, dermatomyositis), fra patologilaboratoriet på Tenon-hospitalet (Dr. Moguelet).
• Som kontroller, humane biopsier af sund hud fra patienter i forskellige aldre, (margin for hudtumorfjernelse), fra Tenon Hospital. Vi vil fokusere på patienter med fremskreden hudældning, især patienter med solelastose. Denne model af UV-induceret ændring af elastiske fibre er en stor kontrol med hensyn til ikke-inflammatoriske og ikke-kalcificerede elastiske fibre skader.
• Kutane biopsier fra musemodellen af ​​PXE (ABCC6 KO-mus) og fra matchede kontrolmus, fra INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protokoller. Alle disse biopsier vil blive karakteriseret ved multifotonmikroskopi ved at kombinere 2PEF og SHG kontraster for samtidig at afbilde elastiske og kollagenfibre. I et første trin vil den eksperimentelle protokol være som følger:

• Produktion på Tenon Hospital af flere serieglas fra hver biopsi: 1 ufarvet ("hvid") objektglas til multifoton-billeddannelse, 1 objektglas med sædvanlig morfologisk farvning (hematoxylin-eosin-safran, HES), 1 objektglas med farvning, der fremhæver calciumaflejringer (Von Kossa) ) og 3 objektglas med immunhistokemiske mærkninger af de vigtigste MMP'er (antistoffer mod MMP-1, 2 og 9).
• billeddannelse ved LOB på et standard optisk lysfeltsmikroskop (standard og polariseret transmitteret lys, fluorescens, DIC) af alle de farvede objektglas over et stort synsfelt ved mosaik; identifikation af regioner af interesse (ROI) svarende til inflammatoriske processer, vævsremodellering eller mineralaflejringer. Bemærk, at mineralaflejringer afsløres af polariseret transmitteret lys eller ved fasekontrast eller DIC.
• Røntgenfluorescensbilleddannelse ved Soleil Synchrotron for at identificere de metalliske aflejringer, der er til stede i biopsierne, især zink. Dette vil ske i samarbejde med Dominique Bazin (Institute of Physico-Chemistry, CNRS, Paris-Saclay University), som har en stærk ekspertise inden for mineralsk billeddannelse i Diffabs-linjen.
• Multifoton-billeddannelse ved LOB af de identificerede områder af interesse, eller endda på et stort synsfelt ved automatisk at sy flere fliser. Polarisationsopløste billeder vil også blive udført i meget tætte områder eller i ombyggede områder for at kortlægge retningen af ​​kollagen- og elastinfibre (10).
• Automatiseret kvantitativ analyse af multifoton LOB-billeder for at måle flere parametre relateret til mængden og strukturen af ​​elastin. Automatiserede kvantitative analyser vil også blive udført på kollagen og andre strukturer af interesse observeret på multifotonbilleder eller histologiske billeder. Resultaterne af de forskellige billeddannelsesmodaliteter vil blive korreleret på hver serie af dias. Bemærk, at automatisk analyse er afgørende både for at undgå de sædvanlige skævheder ved semi-kvantitativ analyse og for at opnå mere informative strukturelle parametre. For eksempel vil følgende parametre blive ekstraheret fra elastinbillederne: den gennemsnitlige tæthed af de elastiske fibre (pr. cm², i den papillære dermis og i den retikulære dermis), orienteringsfordelingen af ​​de elastiske fibre, entropien og den cirkulære varians af denne fordeling, graden af ​​krumning af de elastiske fibre, deres afstand fra mineralaflejringerne.
• Statistisk analyse af multimodale data baseret på passende statistiske tests. A priori ikke-parametriske tests (Wilcoxon-Mann-Whitney) vil blive brugt i lyset af det relativt lille antal tilgængelige humane prøver. Der vil blive undersøgt minimum 8 patienter pr. gruppe, hvilket burde være tilstrækkeligt på grund af nøjagtigheden og reproducerbarheden af ​​de automatiserede målinger. Hvis der udføres flere prøver eller billedserier på den samme patient, vil indlejrede statistiske tests blive brugt (indlejrede t-tests eller indlejrede Wilcoxon).

I et andet trin og baseret på resultaterne af det første trin, vil forskellige elementer i denne protokol blive forbedret for at få adgang til flere oplysninger:

• Multifoton-billeddannelse vil blive udført i intakte murine hudbiopsier for bedre at fremhæve 3D-organiseringen af ​​elastin.
• Avanceret fluorescensbilleddannelse af inflammation vil blive udført i ex vivo murin hud ved hjælp af spektral- eller FLIM-målinger (fluorescens-lifetime imaging microscopy)

• Third Harmonic Generation (THG) vil blive brugt til at visualisere strukturen af ​​mineralforekomsterne.

  1. Bazin D, et al. Karakterisering og nogle fysisk-kemiske aspekter af patologiske mikrokalcifikationer. Chem Rev. 10 okt 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Lokalisering, morfologiske træk og kemisk sammensætning af calciphylaxis-relaterede hudaflejringer hos patienter med calcific uremisk arteriolopati. JAMA Dermatology 2019.
  3. H Colboc, et al. Fysisk-kemisk karakterisering af uorganiske aflejringer forbundet med granulomer i kutan sarkoidose. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology 2018.
  4. Haka AS, et al. Identifikation af mikrokalcifikationer i benigne og ondartede brystlæsioner ved at undersøge forskelle i deres kemiske sammensætning ved hjælp af Raman-spektroskopi. Cancer Res. 15 sept 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Vægttab-induceret calciphylaxis: potentiel rolle af matrix metalloproteinaser. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nouvel outil pour l'évaluation des produits cosmétiques." Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn, et al. "Aldersrelaterede morfologiske ændringer af den dermale matrix i menneskelig hud dokumenteret in vivo ved multifotonmikroskopi." Journal of biomedical optics 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Kvantificering af aorta og kutan elastin og kollagenmorfologi i Marfans syndrom ved multifotonmikroskopi." Journal of structural biology 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "En kvantitativ tilgang til histopatologisk dissektion af elastin-relaterede lidelser ved hjælp af multifotonmikroskopi." British Journal of Dermatology 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. Lopez-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire og M.-C. Schanne-Klein, "Overvågning af dynamisk kollagenreorganisering under hudstrækning med hurtig polarisationsopløst SHG-billeddannelse." J. Biophot. 12, e201800336 (2019).