Alteración de las fibras elásticas dérmicas durante la dermatosis calcificante: estudio estructural mediante microscopía multifotónica (Calciphoton)

La variedad de patologías acompañadas de depósitos minerales en los tejidos es grande (cánceres, procesos infecciosos, enfermedades ambientales) (1). En dermatología, varias patologías se asocian con depósitos minerales de calcio, como la calcifilaxis y el pseudoxantoma elástico (PXE). Hasta la fecha se han realizado pocos estudios sobre las características químicas de los depósitos minerales cutáneos, sus consecuencias fisiopatológicas, la aparición de patologías asociadas y sus repercusiones en los órganos humanos.

Esto ha motivado el proyecto de doctorado de Hester COLBOC, M.D., sobre la caracterización de los depósitos de calcio en diversas dermatosis calcificantes, incluidas la calcifilaxis (2) y la sarcoidosis (3). Este proyecto fundamental de investigación se lleva a cabo en el marco de una colaboración entre el LCP (Instituto de Fisicoquímica, CNRS, Universidad Paris-Saclay) y AP-HP, en particular en los campos de la uronefrología (litiasis urinaria) y la oncología. (4) (calcificaciones en cáncer de mama y tiroides). Hemos demostrado que las calcificaciones cutáneas consisten en carbapatita en la calcifilaxis y calcita en la sarcoidosis. También hemos demostrado que estos depósitos se encuentran principalmente en las fibras elásticas dérmicas o de la pared de los vasos, lo que sugiere que se debe explorar una vía de nucleación molecular dentro de estas fibras.

Esta descripción estructural y química es innovadora, pero no responde a todas las preguntas que surgen en torno a estos depósitos de calcio: ¿por qué algunos pacientes, que presentan un balance fosfocálcico normal, presentan calcificaciones cutáneas masivas? ¿Por qué, por el contrario, otros pacientes, como algunos pacientes en diálisis, presentan balances fosfocálcicos extremadamente alterados, pero ninguna calcificación cutánea? Esta paradoja plantea la posibilidad de la existencia de "focos de nucleación" dentro de las fibras elásticas dérmicas y vasculares, favoreciendo la precipitación de depósitos fosfocálcicos en algunos pacientes. Algunos modelos in vitro han explorado estos focos de nucleación dentro de las fibras elásticas. (ref. Gourgas et al) Sorprendentemente, la mayoría de las dermatosis calcificantes están precedidas por un estado inflamatorio cutáneo. Estos fenómenos inflamatorios de la piel también podrían inducir la precipitación de los depósitos de calcio. Así, algunos autores especulan que la elastina es digerida por la metaloproteinasa (MMP) en la matriz extracelular, creando así focos de nucleación que favorecen los depósitos fosfocálcicos. Munavalli et al. mostró un aumento del nivel de MMP en la muestra de orina de un paciente con calcifilaxis en un contexto de pérdida de peso rápida (5). Ellos plantean la hipótesis de que los niveles séricos elevados de MMP en este paciente podrían conducir a una alteración del límite elástico externo y calcificaciones vasculares. Esta hipótesis se apoya por otro lado en otros modelos de alteración de las fibras elásticas, como durante el envejecimiento de la piel (dermatoporosis), en los que no hay inflamación ni calcificación.

La hipótesis de fondo de nuestro proyecto es que la inflamación de la piel conduce a una alteración específica de las fibras elásticas, lo que favorece su calcificación.

Para explorar esta hipótesis, particularmente durante la calcifilaxis y PXE, proponemos utilizar microscopía multifotónica, una técnica de imagen disponible en el Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) en la Ecole Polytechnique. La microscopía multifotónica se desarrolló a principios de la década de 1990 como una alternativa a la microscopía confocal, para mejorar la obtención de imágenes detalladas de tejidos biológicos con resolución submicrométrica. Lo que es más importante, la microscopía multifotónica puede combinar varios puntos de contraste en paralelo y sin ningún tipo de etiquetado para identificar los diversos elementos de un tejido. Las señales de segunda generación armónica (SHG) permiten obtener imágenes específicas de colágeno fibrilar no teñido con una sensibilidad inigualable, mientras que la fluorescencia excitada por dos fotones (2PEF) permite obtener imágenes celulares gracias a varios cromóforos celulares intrínsecos, así como imágenes de elastina en la dermis o en otros tejidos (ver Figura 1) (6).

La microscopía multifotónica se ha utilizado en varios estudios sobre la piel, incluso en LOB (ver Figura 1), que han demostrado la alta relevancia de esta técnica para la caracterización estructural de las fibras dérmicas, particularmente las fibras de elastina y colágeno, y su posible alteración. Se ha aplicado al estudio del envejecimiento de la piel, así como a patologías que conducen a la degeneración de las fibras elásticas (PXE) o colágenas (Síndrome de Marfan) (7-9). Por tanto, esta técnica es muy apropiada para explorar la estructura de las fibras elásticas durante fenómenos inflamatorios cutáneos y dermatosis calcificantes.

Paralelamente, el proceso inflamatorio cutáneo será explorado por otros métodos. Se usará inmunohistoquímica para detectar MMP dérmica y fluorescencia de rayos X (en Synchrotron Soleil, línea Diffabs) para evidenciar zinc intradérmico y otros depósitos metálicos, como se hizo en nuestros estudios anteriores (Figura 2).

Figura 2: Fluorescencia de rayos X de una biopsia de piel: ejemplo de correlación entre el infiltrado inflamatorio dérmico (A) y la presencia de zinc intradérmico (B), aquí durante una reacción liquenoide en el tatuaje (imágenes registradas en el Sincrotrón Soleil, línea Diffabs, de S. Reguer, D. Bazin y H. Colboc).

El objetivo principal de nuestro proyecto es caracterizar las alteraciones estructurales de las fibras elásticas durante la dermatosis calcificante.

Los objetivos secundarios son:

• estudiar las consecuencias de los procesos inflamatorios cutáneos sobre la alteración de las fibras elásticas,
• identificar un posible foco de nucleación para la formación de depósitos de fosfo-calcio dentro de las fibras dérmicas y vasculares elásticas.

Muestras de piel. El estudio se realizará principalmente en piel humana, pero también en un modelo de ratón de PXE: ratón ABCC6 KO. Concretamente, la materia estudiada en LOB será:

• Biopsias de piel humana ya recogidas para el diagnóstico de estas dermatosis calcificantes: PXE, calcifilaxis, otras dermatosis inflamatorias calcificantes (paniculitis lúpica, dermatomiositis), del laboratorio de patología del hospital Tenon (Dr. Moguelet).
• Como controles, biopsias humanas de piel sana de pacientes de diferentes edades, (margen de extirpación de tumor cutáneo), del Hospital Tenon. Nos centraremos en pacientes con envejecimiento cutáneo avanzado, especialmente pacientes con elastosis solar. Este modelo de alteración de fibras elásticas inducida por UV es un gran control en términos de daños de fibras elásticas no inflamatorias y no calcificadas.
• Biopsias cutáneas del modelo de ratón de PXE (ratón ABCC6 KO) y de ratones de control emparejados, de INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocolos. Todas estas biopsias se caracterizarán por microscopía multifotónica mediante la combinación de contrastes 2PEF y SHG para obtener imágenes simultáneamente de fibras elásticas y de colágeno. En un primer paso, el protocolo experimental será el siguiente:

• Producción en el Hospital Tenon de varios portaobjetos seriados de cada biopsia: 1 portaobjetos sin teñir ("blanco") para imágenes multifotónicas, 1 portaobjetos con tinción morfológica habitual (hematoxilina-eosina-safran, HES), 1 portaobjetos con tinción que resalta los depósitos de calcio (Von Kossa ) y 3 portaobjetos con marcajes inmunohistoquímicos de las principales MMP (anticuerpos contra MMP-1, 2 y 9).
• formación de imágenes en LOB en un microscopio óptico de campo claro estándar (luz transmitida estándar y polarizada, fluorescencia, DIC) de todos los portaobjetos teñidos en un gran campo de visión mediante mosaicos; identificación de regiones de interés (ROI) correspondientes a procesos inflamatorios, remodelación tisular o depósitos minerales. Tenga en cuenta que los depósitos minerales se revelan por luz transmitida polarizada o por contraste de fase o DIC.
• Imágenes de fluorescencia de rayos X en Soleil Synchrotron para identificar los depósitos metálicos presentes en las biopsias, especialmente Zinc. Esto se hará en colaboración con Dominique Bazin (Instituto de Física y Química, CNRS, Universidad Paris-Saclay), que tiene una gran experiencia en imágenes minerales en la línea Diffabs.
• Imágenes multifotónicas en LOB de las regiones de interés identificadas, o incluso en un gran campo de visión mediante la unión automática de varios mosaicos. También se realizarán imágenes resueltas por polarización en áreas muy densas o en áreas remodeladas para mapear la dirección de las fibras de colágeno y elastina (10).
• Análisis cuantitativo automatizado de imágenes LOB multifotónicas para medir varios parámetros relacionados con la cantidad y estructura de la elastina. También se realizarán análisis cuantitativos automatizados sobre colágeno y otras estructuras de interés observadas en imágenes multifotónicas o imágenes histológicas. Los resultados de las diferentes modalidades de imágenes se correlacionarán en cada serie de diapositivas. Tenga en cuenta que el análisis automático es esencial tanto para evitar los sesgos habituales del análisis semicuantitativo como para obtener parámetros estructurales más informativos. Por ejemplo, de las imágenes de elastina se extraerán los siguientes parámetros: la densidad media de las fibras elásticas (por cm², en la dermis papilar y en la dermis reticular), la distribución de la orientación de las fibras elásticas, la entropía y la varianza circular de esta distribución, el grado de curvatura de las fibras elásticas, su distancia de los depósitos minerales.
• Análisis estadístico de datos multimodales, basado en pruebas estadísticas apropiadas. Se utilizarán pruebas no paramétricas a priori (Wilcoxon-Mann-Whitney) en vista del número relativamente pequeño de muestras humanas disponibles. Se estudiarán un mínimo de 8 pacientes por grupo, lo que debería ser suficiente debido a la precisión y reproducibilidad de las medidas automatizadas. Si se realizan varias muestras o series de imágenes en un mismo paciente, se utilizarán pruebas estadísticas anidadas (test t anidado o Wilcoxon anidado).

En un segundo paso y en base a los resultados del primer paso, se mejorarán varios puntos de este protocolo para acceder a más información:

• Se realizarán imágenes multifotónicas en biopsias de piel murina intacta para resaltar mejor la organización 3D de la elastina.
• Se realizarán imágenes de fluorescencia avanzada de la inflamación en piel murina ex vivo, utilizando mediciones espectrales o FLIM (microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia).

• La Tercera Generación Armónica (THG) se utilizará para visualizar la estructura de los depósitos minerales.

  1. Bazin D, et al. Caracterización y algunos aspectos fisicoquímicos de las microcalcificaciones patológicas. Chem Rev. 10 de octubre de 2012;112(10):5092-120.

La variedad de patologías acompañadas de depósitos minerales en los tejidos es grande (cánceres, procesos infecciosos, enfermedades ambientales) (1). En dermatología, varias patologías se asocian con depósitos minerales de calcio, como la calcifilaxis y el pseudoxantoma elástico (PXE). Hasta la fecha se han realizado pocos estudios sobre las características químicas de los depósitos minerales cutáneos, sus consecuencias fisiopatológicas, la aparición de patologías asociadas y sus repercusiones en los órganos humanos.

Esto ha motivado el proyecto de doctorado de Hester COLBOC, M.D., sobre la caracterización de los depósitos de calcio en diversas dermatosis calcificantes, incluidas la calcifilaxis (2) y la sarcoidosis (3). Este proyecto fundamental de investigación se lleva a cabo en el marco de una colaboración entre el LCP (Instituto de Fisicoquímica, CNRS, Universidad Paris-Saclay) y AP-HP, en particular en los campos de la uronefrología (litiasis urinaria) y la oncología. (4) (calcificaciones en cáncer de mama y tiroides). Hemos demostrado que las calcificaciones cutáneas consisten en carbapatita en la calcifilaxis y calcita en la sarcoidosis. También hemos demostrado que estos depósitos se encuentran principalmente en las fibras elásticas dérmicas o de la pared de los vasos, lo que sugiere que se debe explorar una vía de nucleación molecular dentro de estas fibras.

Esta descripción estructural y química es innovadora, pero no responde a todas las preguntas que surgen en torno a estos depósitos de calcio: ¿por qué algunos pacientes, que presentan un balance fosfocálcico normal, presentan calcificaciones cutáneas masivas? ¿Por qué, por el contrario, otros pacientes, como algunos pacientes en diálisis, presentan balances fosfocálcicos extremadamente alterados, pero ninguna calcificación cutánea? Esta paradoja plantea la posibilidad de la existencia de "focos de nucleación" dentro de las fibras elásticas dérmicas y vasculares, favoreciendo la precipitación de depósitos fosfocálcicos en algunos pacientes. Algunos modelos in vitro han explorado estos focos de nucleación dentro de las fibras elásticas. (ref. Gourgas et al) Sorprendentemente, la mayoría de las dermatosis calcificantes están precedidas por un estado inflamatorio cutáneo. Estos fenómenos inflamatorios de la piel también podrían inducir la precipitación de los depósitos de calcio. Así, algunos autores especulan que la elastina es digerida por la metaloproteinasa (MMP) en la matriz extracelular, creando así focos de nucleación que favorecen los depósitos fosfocálcicos. Munavalli et al. mostró un aumento del nivel de MMP en la muestra de orina de un paciente con calcifilaxis en un contexto de pérdida de peso rápida (5). Ellos plantean la hipótesis de que los niveles séricos elevados de MMP en este paciente podrían conducir a una alteración del límite elástico externo y calcificaciones vasculares. Esta hipótesis se apoya por otro lado en otros modelos de alteración de las fibras elásticas, como durante el envejecimiento de la piel (dermatoporosis), en los que no hay inflamación ni calcificación.

La hipótesis de fondo de nuestro proyecto es que la inflamación de la piel conduce a una alteración específica de las fibras elásticas, lo que favorece su calcificación.

Para explorar esta hipótesis, particularmente durante la calcifilaxis y PXE, proponemos utilizar microscopía multifotónica, una técnica de imagen disponible en el Laboratoire d'Optique et Biosciences (LOB) en la Ecole Polytechnique. La microscopía multifotónica se desarrolló a principios de la década de 1990 como una alternativa a la microscopía confocal, para mejorar la obtención de imágenes detalladas de tejidos biológicos con resolución submicrométrica. Lo que es más importante, la microscopía multifotónica puede combinar varios puntos de contraste en paralelo y sin ningún tipo de etiquetado para identificar los diversos elementos de un tejido. Las señales de segunda generación armónica (SHG) permiten obtener imágenes específicas de colágeno fibrilar no teñido con una sensibilidad inigualable, mientras que la fluorescencia excitada por dos fotones (2PEF) permite obtener imágenes celulares gracias a varios cromóforos celulares intrínsecos, así como imágenes de elastina en la dermis o en otros tejidos (ver Figura 1) (6).

La microscopía multifotónica se ha utilizado en varios estudios sobre la piel, incluso en LOB (ver Figura 1), que han demostrado la alta relevancia de esta técnica para la caracterización estructural de las fibras dérmicas, particularmente las fibras de elastina y colágeno, y su posible alteración. Se ha aplicado al estudio del envejecimiento de la piel, así como a patologías que conducen a la degeneración de las fibras elásticas (PXE) o colágenas (Síndrome de Marfan) (7-9). Por tanto, esta técnica es muy apropiada para explorar la estructura de las fibras elásticas durante fenómenos inflamatorios cutáneos y dermatosis calcificantes.

Paralelamente, el proceso inflamatorio cutáneo será explorado por otros métodos. Se usará inmunohistoquímica para detectar MMP dérmica y fluorescencia de rayos X (en Synchrotron Soleil, línea Diffabs) para evidenciar zinc intradérmico y otros depósitos metálicos, como se hizo en nuestros estudios anteriores (Figura 2).

Figura 2: Fluorescencia de rayos X de una biopsia de piel: ejemplo de correlación entre el infiltrado inflamatorio dérmico (A) y la presencia de zinc intradérmico (B), aquí durante una reacción liquenoide en el tatuaje (imágenes registradas en el Sincrotrón Soleil, línea Diffabs, de S. Reguer, D. Bazin y H. Colboc).

El objetivo principal de nuestro proyecto es caracterizar las alteraciones estructurales de las fibras elásticas durante la dermatosis calcificante.

Los objetivos secundarios son:

• estudiar las consecuencias de los procesos inflamatorios cutáneos sobre la alteración de las fibras elásticas,
• identificar un posible foco de nucleación para la formación de depósitos de fosfo-calcio dentro de las fibras dérmicas y vasculares elásticas.

Muestras de piel. El estudio se realizará principalmente en piel humana, pero también en un modelo de ratón de PXE: ratón ABCC6 KO. Concretamente, la materia estudiada en LOB será:

• Biopsias de piel humana ya recogidas para el diagnóstico de estas dermatosis calcificantes: PXE, calcifilaxis, otras dermatosis inflamatorias calcificantes (paniculitis lúpica, dermatomiositis), del laboratorio de patología del hospital Tenon (Dr. Moguelet).
• Como controles, biopsias humanas de piel sana de pacientes de diferentes edades, (margen de extirpación de tumor cutáneo), del Hospital Tenon. Nos centraremos en pacientes con envejecimiento cutáneo avanzado, especialmente pacientes con elastosis solar. Este modelo de alteración de fibras elásticas inducida por UV es un gran control en términos de daños de fibras elásticas no inflamatorias y no calcificadas.
• Biopsias cutáneas del modelo de ratón de PXE (ratón ABCC6 KO) y de ratones de control emparejados, de INSERM Unit 1155, Tenon Hospital.

Protocolos. Todas estas biopsias se caracterizarán por microscopía multifotónica mediante la combinación de contrastes 2PEF y SHG para obtener imágenes simultáneamente de fibras elásticas y de colágeno. En un primer paso, el protocolo experimental será el siguiente:

• Producción en el Hospital Tenon de varios portaobjetos seriados de cada biopsia: 1 portaobjetos sin teñir ("blanco") para imágenes multifotónicas, 1 portaobjetos con tinción morfológica habitual (hematoxilina-eosina-safran, HES), 1 portaobjetos con tinción que resalta los depósitos de calcio (Von Kossa ) y 3 portaobjetos con marcajes inmunohistoquímicos de las principales MMP (anticuerpos contra MMP-1, 2 y 9).
• formación de imágenes en LOB en un microscopio óptico de campo claro estándar (luz transmitida estándar y polarizada, fluorescencia, DIC) de todos los portaobjetos teñidos en un gran campo de visión mediante mosaicos; identificación de regiones de interés (ROI) correspondientes a procesos inflamatorios, remodelación tisular o depósitos minerales. Tenga en cuenta que los depósitos minerales se revelan por luz transmitida polarizada o por contraste de fase o DIC.
• Imágenes de fluorescencia de rayos X en Soleil Synchrotron para identificar los depósitos metálicos presentes en las biopsias, especialmente Zinc. Esto se hará en colaboración con Dominique Bazin (Instituto de Física y Química, CNRS, Universidad Paris-Saclay), que tiene una gran experiencia en imágenes minerales en la línea Diffabs.
• Imágenes multifotónicas en LOB de las regiones de interés identificadas, o incluso en un gran campo de visión mediante la unión automática de varios mosaicos. También se realizarán imágenes resueltas por polarización en áreas muy densas o en áreas remodeladas para mapear la dirección de las fibras de colágeno y elastina (10).
• Análisis cuantitativo automatizado de imágenes LOB multifotónicas para medir varios parámetros relacionados con la cantidad y estructura de la elastina. También se realizarán análisis cuantitativos automatizados sobre colágeno y otras estructuras de interés observadas en imágenes multifotónicas o imágenes histológicas. Los resultados de las diferentes modalidades de imágenes se correlacionarán en cada serie de diapositivas. Tenga en cuenta que el análisis automático es esencial tanto para evitar los sesgos habituales del análisis semicuantitativo como para obtener parámetros estructurales más informativos. Por ejemplo, de las imágenes de elastina se extraerán los siguientes parámetros: la densidad media de las fibras elásticas (por cm², en la dermis papilar y en la dermis reticular), la distribución de la orientación de las fibras elásticas, la entropía y la varianza circular de esta distribución, el grado de curvatura de las fibras elásticas, su distancia de los depósitos minerales.
• Análisis estadístico de datos multimodales, basado en pruebas estadísticas apropiadas. Se utilizarán pruebas no paramétricas a priori (Wilcoxon-Mann-Whitney) en vista del número relativamente pequeño de muestras humanas disponibles. Se estudiarán un mínimo de 8 pacientes por grupo, lo que debería ser suficiente debido a la precisión y reproducibilidad de las medidas automatizadas. Si se realizan varias muestras o series de imágenes en un mismo paciente, se utilizarán pruebas estadísticas anidadas (test t anidado o Wilcoxon anidado).

En un segundo paso y en base a los resultados del primer paso, se mejorarán varios puntos de este protocolo para acceder a más información:

• Se realizarán imágenes multifotónicas en biopsias de piel murina intacta para resaltar mejor la organización 3D de la elastina.
• Se realizarán imágenes de fluorescencia avanzada de la inflamación en piel murina ex vivo, utilizando mediciones espectrales o FLIM (microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia).

• La Tercera Generación Armónica (THG) se utilizará para visualizar la estructura de los depósitos minerales.

  1. Bazin D, et al. Caracterización y algunos aspectos fisicoquímicos de las microcalcificaciones patológicas. Chem Rev. 10 de octubre de 2012;112(10):5092-120.
  2. H Colboc, et al. Localización, características morfológicas y composición química de los depósitos cutáneos relacionados con la calcifilaxis en pacientes con arteriolopatía urémica calcificada. JAMA Dermatología 2019.
  3. H Colboc, et al. Caracterización fisicoquímica de depósitos inorgánicos asociados a granulomas en sarcoidosis cutánea. Revista de la Academia Europea de Dermatología y Venereología 2018.
  4. HakaAS, et al. Identificación de microcalcificaciones en lesiones mamarias benignas y malignas mediante el sondeo de diferencias en su composición química mediante espectroscopia Raman. Cáncer Res. 15 de septiembre de 2002;62(18):5375-80.
  5. Munavalli G, et al. Calcifilaxis inducida por la pérdida de peso: papel potencial de las metaloproteinasas de matriz. J Dermatol. 2003;30(12):915-919.
  6. Schanne-Klein M-C. "L'imagerie multiphoton des peaux naturelles et synthétiques. Un nuevo resultado para la evaluación de los productos cosméticos". Photoniques 88 (2017): 21-24.
  7. Wang, Hequn y col. "Cambios morfológicos relacionados con la edad de la matriz dérmica en la piel humana documentados in vivo mediante microscopía multifotónica". Revista de óptica biomédica 23.3 (2018): 030501.
  8. Cui, Jason Z., et al. "Cuantificación de la elastina aórtica y cutánea y la morfología del colágeno en el síndrome de Marfan mediante microscopía multifotónica". Revista de biología estructural 187.3 (2014): 242-253.
  9. Tong, P.L., et al. "Un enfoque cuantitativo para la disección histopatológica de los trastornos relacionados con la elastina mediante microscopía multifotónica". Revista británica de dermatología 169.4 (2013): 869-879.
  10. G. Ducourthial, J.-S. Affagard, M. Schmeltz, X. Solinas, M. López-Poncelas, C. Bonod-Bidaud, R. Rubio-Amador, F. Ruggiero, J.-M. Allain, E. Beaurepaire y M.-C. Schanne-Klein, "Monitoreo de la reorganización dinámica del colágeno durante el estiramiento de la piel con imágenes SHG resueltas con polarización rápida". J. Biofoto. 12, e201800336 (2019).