原発性特発性不妊症の女性における炎症誘発性サイトカインと着床過程

不妊症は、世界中の生殖年齢のカップルの約 8 ～ 12% に影響を及ぼしており、これは 1 億 8,600 万人以上に相当します。

カップルの約 20% では、不妊の原因物質は定期的な診断テストの後で特定できません。 特発性不妊症の原因の 1 つは、着床プロセスの障害である可能性があります。

着床は、着床する胚盤胞の能力が、子宮内膜による胚盤胞の受容の準備、いわゆる子宮内膜受容性と重なるときに、月経周期の特定の時点で行うことができます。

子宮内膜がこの特性を示す時間間隔は、着床ウィンドウと呼ばれます。

ヒトの着床期間は 3 ～ 6 日間で、分泌期の半分、つまり LH ピークから 6 ～ 10 日後になります。

子宮内膜による受容性の獲得は、細胞および構造の変化に反映されます。

このプロセスは、卵巣由来のエストロゲンとプロゲステロンによってホルモン的に制御されています。 さらに、オートクリン、パラクリン、およびジャクスタクリン シグナル伝達を介した、サイトカイン、成長因子、脂質メディエーターなどの局所的に生成されるシグナル伝達分子が重要です。

遺伝的に受容的で決定的であるのは、Hoxa10 および Hoxa11 ホメオボックス遺伝子によって駆動され、その発現はステロイド ホルモンの作用によって増加します。 子宮内膜内の細胞および分子レベルでの変化は、癌浸潤の過程における創傷治癒およびマトリックスの分解などの過程と比較されます。

子宮内膜に浸潤する免疫系の細胞の中では、マクロファージ、リンパ球、NK細胞などの単核細胞が優勢です。

生殖能力における局所炎症の役割を考慮する際には、中等度または低強度の急性炎症と慢性炎症を区別することが不可欠です。

炎症反応の急性期では、免疫系の細胞は、サイトカイン、ケモカイン、急性期タンパク質などの可溶性メディエーターによって促進される慎重に計画された一連のイベントで損傷部位に移動します。 損傷の重症度にもよりますが、この急性期は損傷を修復して治癒プロセスを開始するのに十分な場合があります。

長期にわたる刺激への曝露または自身の組織に対する不適切な反応の結果としての炎症の長期化は、組織の損傷および線維症が発生する可能性がある慢性期につながる可能性があります。

特定の炎症で見られる分子のプロファイルは、炎症プロセスに関与する重症度、期間、メカニズム、および体の免疫系が反応して適応する能力によって異なります。

この研究の目的は、選択された炎症性分子 - インターロイキン 18 とヒスタミン - のレベルが、自然妊娠した子孫を持つ女性と比較して未確定不妊症の女性集団で異なるかどうかを調査することでした.

材料と方法 前向き横断研究を行った。 研究デザインは、2017 年 6 月 29 日付けの Jagiellonian University No. 1072.6120.78.2017 の生命倫理委員会の肯定的な意見を受けました。資金は、科学高等教育省の助成金 No. K / DSC / 00421 から得られました。 研究グループは原発性不妊症と診断された 58 人の女性で構成され、対照グループは自然に妊娠した子孫を持つ 8 人の患者で構成されました。 患者は、2017 年 11 月から 2020 年 3 月までの期間に、婦人科内分泌および婦人科クリニックに入院し、婦人科内分泌クリニックで相談され、総合的なリプロダクティブ ヘルス プログラムの下で診断された女性の中から募集されました。

研究グループの選択基準は、生殖可能年齢（18～40歳）の女性で、原発性不妊症（1年以上妊娠しようとして失敗した）を患い、定期的に月経があり、ホルモン療法を使用していない女性によって満たされました.

除外基準は、不妊症の確立された男性因子、卵管因子、子宮内膜症、骨盤領域の炎症-現在および過去の歴史、不妊症のホルモン背景、肥満、インスリン抵抗性、少なくとも1回の流産後の状態、および慢性自己免疫疾患でした。

対照群の選択基準は、生殖可能年齢（18～40 歳）で、3 歳までの子孫が自然妊娠し、定期的な月経がある患者によって満たされました。 除外基準は、子宮腔の掻爬を含む子宮の手術後の状態、子宮内膜症、骨盤内炎症の存在および病歴、少なくとも1回の流産、肥満、インスリン抵抗性、慢性自己免疫疾患、母乳育児でした。

研究のために募集された両方のグループからの患者は、移植期間中に検査されました。 周期の適切なタイミングは、超音波排卵モニタリングによって決定されました。 患者は、支配的な卵胞の成長を観察するために、周期の約 10 日目に報告しました。 検査は 3～4 日後に繰り返された。 優位な卵胞発育が確認された場合、患者は、予想される月経開始の 16 日前に自宅で尿 LH テストを実施しました。 患者は、LH ピークの 6 ～ 8 日後、または疑わしい検査結果の場合は、報告された月経周期の長さによって決定される黄体期の中間、つまり生理予定日の 8 ～ 4 日前に報告しました。 訪問中、過去の排卵を確認するために超音波検査が行われました（同一の卵巣、子宮内膜の幅が少なくとも10 mmの黄体の観察）。

患者は、研究が実施されたサイクルで性交を断念する必要性について知らされ、これは研究文書で確認されました。 この要件を受け入れない患者は、研究に参加できませんでした。 来院時、排卵が確認された後、直径約2mmのプラスチック製ピペットを用いて子宮内膜吸引生検を行った。 3 mm (ピペル子宮内膜吸引キュレット)。 ピペットで子宮頸管を貫通するのが困難な場合は、子宮頸部の上唇をクランプでつかみました。 患者に激しい痛みがある場合、または子宮頸管を貫通できない場合、材料の収集は中止されました。 検査の直後に、患者は手順中の痛みの強さを数値評価尺度 (NRS) で数値的に評価するように求められました。ここで、0 はまったく痛みがなく、10 は想像できる最悪の痛みです。 どの患者にも合併症はありませんでした。 採取された子宮内膜サンプルは、室温で 10% の中性緩衝ホルマリン溶液に保存され、パラフィン ブロックで固定するために CMUJ 臨床および実験病理学部門に移送されました。

同じ日に、EDTA 上の 5 ml の静脈血サンプルを各患者から採取しました。 血液を 3000 rpm で 15 分間遠心分離し、IL-18 とヒスタミンのレベルを測定するために、血清を Jagiellonian University Medical College の臨床生化学部門に送りました。

免疫組織化学 組織材料をホルムアルデヒドで 24 時間固定しました。 70%エタノール溶液で脱水後、パラフィン包埋した。 組織を 4 μm の厚さに切断し、シラン処理したスライドに取り付けました。 セクションは 3 つの等しいセットに分割されました。 パラフィン調製物を脱ロウし（室温で３回キシレン交換；最初の交換は１０分後、２回目と３回目は１５分後に交換）、再水和した（室温で３回のアルコール交換、各５分）。 次に、調製物を室温で10分間インキュベートした。 内因性ペルオキシダーゼをブロックするための 3% H2O2 溶液。 スライドを蒸留水でリンスし、ＴＢＳと共に５分間インキュベートした。 次に、スライドを97℃のウォーターバスでpH 6.0のクエン酸緩衝液でマスクを外しました。 プレパレーションのマスクを外した後、Ultra Vision Protein Block プレパレーション (Thermo Scientific) を 5 分間適用しました。 湿気のある部屋で室温で。 次に、適切な抗体を適用し、指定された時間、湿度の高いチャンバー内で室温でインキュベートしました (表 1)。 切片の最初のセットは、IL-18 反応性ウサギ ポリクローナル抗体 (組換え IL18 (Tyr37 ~ Asp193)、Cloud-Clone Corp.、0.33 mg/ml Cat. No. PAA064HU01) を 1:00 希釈で 60 分間。 第２セットは、ヒスタミン反応性ウサギポリクローナル抗体（組換えヒトヒスタミン（Ｍｅｔ１～Ｉｌｅ１６３）、Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、０．３５ｍｇ／ｍｌ、カタログ番号． PAA927Ge01) を 1: 100 の希釈で 30 分間。 第３のセットは、ウサギポリクローナル抗体（組換えヒトＧＬＵＴ４（Ｍｅｔ１～Ｉｌｅ１６３）Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号． PAC023HU01) を 1:50 に希釈して 30 分間。 過剰な抗体をTBS緩衝液で洗浄し、Bright Vision plus (BrightVision + ヤギ抗マウス/ウサギHRP - ImmunoLogicキット) のポスト抗体ブロッキングを適用しました。 室温の湿ったチャンバーで20分間インキュベートします。

過剰な試薬をTBS緩衝液で洗い流し、ポリHRP-GAMs/Rb IgG調製物(BrightVision + ヤギ抗マウス/ウサギHRP - ImmunoLogicキット)を適用しました。 加湿チャンバー内で室温で 30 分間インキュベートします。 過剰な試薬をTBS緩衝液で洗い流し、DAB Quanto (Thermo Scientific)を適用した。 加湿チャンバー内で室温で約 5 分間インキュベートします。 次に、余分な試薬を蒸留水ですすぎ、スライドをヘマトキシリン（Thermo Scientific）で着色しました。 調製物は、濃度を上げながらアルコールとキシレンの一連の３回の交換を行うことによって脱水された。 カバースリップ（ThermoScientificによるCYTOSEAL）で閉じました。 各サイトカインの発現は、イメージ アナライザーを使用して計算された、分析されたサンプル中の 1 平方ミリメートルあたりの陽性細胞の数として半定量的に評価されました。

血中のIL-18とヒスタミン 血清IL-18の測定は、ヒト組換えIL-18（ヒトIL-18 ELISAキット、Biorbyt、カタログ番号. Orb50153)。 血液サンプルと試薬を 37 ° C に加温し、完全かつ均一に混合しながら 50 μL のバッファーを使用して希釈剤で 1:2 に希釈しました。 溶液は１ウェルあたり０．１ｍｌ分注した。 ウェルを入れたマイクロタイタープレートを蓋で覆い、37℃で90分間インキュベートした。 次にプレートを乾燥させ、0.1mlのビオチン化抗ヒトIL-18抗体溶液を各ウェルに加え、37℃で60分間インキュベートした。 次いで、プレートを０．０１Ｍ ＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、そのたびに洗浄緩衝液をウェルに１分間残した。 バッファーを除去し、プレートを乾燥させた後、調製したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ (ABC) 溶液 0.1 ml を各ウェルに加え、プレートを 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 プレートを再びすすぎ、今回は 0.01 M TBS で 5 回洗浄し、ウェル内に洗浄バッファーを毎回 1 ～ 2 分間残しました。 バッファーを除去し、プレートを乾燥させた後、90 μl の TMB 色素を各ウェルに加え、プレートを 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 ０．１ｍｌのＴＭＢ造影剤溶液を各ウェルに添加し、吸光度を４５０ｎｍで直ちに測定した。 ヒスタミン ELISA Immundiagnostik 試薬、カタログ番号 K 8212 を使用して、血清ヒスタミン レベルを ELISA で測定しました。 濃縮洗浄緩衝液（ＷＡＳＨＢＵＦ Ｂ）を純水で１：１０に希釈した。 試薬を室温にした。 血漿サンプルを誘導体化試薬と混合した。 次いで、誘導体化サンプルを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒスタミン抗体と一緒に、ヒスタミン誘導体被覆ＥＬＩＳＡプレート上で室温で１時間、水平シェーカー上でインキュベートした。 次に、ウェルの内容物を250μlの洗浄バッファーで5回洗浄した。 最後のステップの後、残りのバッファーをティッシュペーパーで取り除きました。 次いで、１００μｌの基質（ＳＵＢ）をピペットで各ウェルに入れ、遮光して室温で１５分間インキュベートした。造影剤溶液 100 μl を各ウェルに加えた。 吸光度はすぐに 450 nm で測定されました。 結果はミリリットルあたりのピコグラムで表されます。

統計分析。 統計分析は、Statistica プログラム (StatSoft 13.3) を使用して実行されました。 調査された変数と提示された度数チャートのシャピロ・ウィルク正規性検定は、変数の分布が正規ではないことを示しました。 ノンパラメトリック Wald-Wolfowitz および U Mann-Whitney 検定を使用して、研究グループと対照グループを比較しました。 相関係数の有意性検定は、スチューデントの t 分布の統計に基づいていました。