Pro-inflammatoire cytokines en implantatieproces bij vrouwen met primaire idiopathische onvruchtbaarheid

Onvruchtbaarheid treft wereldwijd ongeveer 8 tot 12% van de paren in de reproductieve leeftijd, wat overeenkomt met meer dan 186 miljoen mensen.

Bij ongeveer 20% van de paren kan de veroorzaker van onvruchtbaarheid niet worden geïdentificeerd na routinematige diagnostische tests. Een van de oorzaken van idiopathische onvruchtbaarheid kunnen stoornissen van het implantatieproces zijn.

Implantatie kan plaatsvinden op een specifiek punt in de menstruatiecyclus, wanneer het vermogen van de blastocyst om te implanteren wordt overlapt met de gereedheid voor acceptatie door het endometrium, de zogenaamde endometriale ontvankelijkheid.

Het tijdsinterval waarin het endometrium deze eigenschap vertoont, wordt het implantatievenster genoemd.

Het implantatievenster bij mensen is een periode van 3 tot 6 dagen, het valt op de helft van de secretoire fase - dat wil zeggen 6 tot 10 dagen na de LH-piek.

De verwerving van ontvankelijkheid door het endometrium wordt weerspiegeld in cellulaire en structurele veranderingen.

De processen worden hormonaal gecontroleerd door oestrogenen en progesteron van ovariële oorsprong. Daarnaast zijn lokaal geproduceerde signaalmoleculen zoals cytokines, groeifactoren en lipidenmediatoren via autocriene, paracriene en juxtacrinesignalering belangrijk.

Genetisch ontvankelijk en beslissend worden aangedreven door de homeobox-genen Hoxa10 en Hoxa11, waarvan de expressie wordt verhoogd door de werking van steroïde hormonen. Veranderingen op cellulair en moleculair niveau in het endometrium worden vergeleken met processen zoals wondgenezing en afbraak van de matrix tijdens het proces van kankerinvasie.

Onder de cellen van het immuunsysteem die het endometrium infiltreren, domineren mononucleaire cellen: macrofagen, lymfocyten en NK-cellen.

Bij het overwegen van de rol van lokale ontsteking bij de vruchtbaarheid, is het essentieel om onderscheid te maken tussen acute en chronische ontsteking van matige of lage intensiteit.

In de acute fase van de ontstekingsreactie migreren cellen van het immuunsysteem naar de plaats van de verwonding in een zorgvuldig geplande opeenvolging van gebeurtenissen die worden gefaciliteerd door oplosbare mediatoren zoals cytokines, chemokines en acute fase-eiwitten. Afhankelijk van de ernst van het letsel kan deze acute fase voldoende zijn om de schade te herstellen en genezingsprocessen op gang te brengen.

Langdurige ontsteking, als gevolg van langdurige blootstelling aan stimulatie of een ongepaste reactie tegen het eigen weefsel, kan leiden tot een chronische fase, waarin weefselbeschadiging en fibrose kunnen optreden.

Het profiel van de moleculen die bij een bepaalde ontsteking worden waargenomen, hangt af van de ernst, de duur en de mechanismen die betrokken zijn bij het ontstekingsproces, evenals het vermogen van het immuunsysteem van het lichaam om te reageren en zich aan te passen.

Het doel van de studie was om te onderzoeken of de niveaus van geselecteerde ontstekingsmoleculen - interleukine18 en histamine - verschillen in de populatie van vrouwen met onbepaalde onvruchtbaarheid in vergelijking met vrouwen met natuurlijk verwekte nakomelingen.

Materialen en methoden Er werd een prospectieve, cross-sectionele studie uitgevoerd. Het onderzoeksontwerp kreeg een positief advies van de Bioethics Committee van de Jagiellonian University nr. 1072.6120.78.2017 van 29 juni 2017. De fondsen werden verkregen van de beurs nr. K / DSC / 00421 van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs. De onderzoeksgroep bestond uit 58 vrouwen met de diagnose primaire onvruchtbaarheid en een controlegroep bestond uit 8 patiënten met natuurlijk verwekte nakomelingen. Patiënten werden gerekruteerd uit vrouwen die in het ziekenhuis waren opgenomen in de Gynaecologische Endocrinologie- en Gynaecologische Kliniek, geraadpleegd in de Gynaecologische Endocrinologische Kliniek en gediagnosticeerd in het kader van het Comprehensive Reproductive Health Program in de periode van november 2017 tot maart 2020.

Aan de inclusiecriteria voor de studiegroep werd voldaan door vrouwen in de vruchtbare leeftijd (18-40 jaar oud) die leden aan primaire onvruchtbaarheid (meer dan een jaar zonder succes proberen zwanger te worden), regelmatig menstrueren, geen hormoontherapie gebruiken.

De uitsluitingscriteria waren: vastgestelde mannelijke factor van onvruchtbaarheid, eileidersfactor, endometriose, ontsteking in het bekkengebied - momenteel en in de geschiedenis, hormonale achtergrond van onvruchtbaarheid, obesitas, insulineresistentie, status na ten minste één miskraam en chronische auto-immuunziekten.

Aan de opnamecriteria voor de controlegroep werd voldaan door patiënten in de vruchtbare leeftijd (18-40 jaar) met natuurlijk verwekte nakomelingen tot drie jaar oud, met regelmatige menstruatie. De exclusiecriteria waren: toestand na operatie aan de baarmoeder, inclusief curettage van de baarmoederholte, endometriose, bekkenontsteking - aanwezig en in de geschiedenis, minstens één miskraam, obesitas, insulineresistentie, chronische auto-immuunziekten, borstvoeding.

Patiënten uit beide groepen die voor het onderzoek waren gerekruteerd, werden onderzocht tijdens het implantatievenster. De juiste timing van de cyclus werd bepaald door ultrasone ovulatiemonitoring. Patiënten meldden zich rond dag 10 van de cyclus om de groei van de dominante follikel te observeren. Het onderzoek werd na 3-4 dagen herhaald. Als de dominante follikelgroei werd bevestigd, voerde de patiënt 16 dagen voor het verwachte begin van de menstruatie thuis een urine-LH-test uit. Patiënten meldden 6-8 dagen na de LH-piek of, in het geval van een dubieus testresultaat, midden in de luteale fase bepaald door de gerapporteerde lengte van de menstruatiecycli - 8-4 dagen vóór de dag van de verwachte menstruatie. Tijdens het bezoek werd een echografisch onderzoek uitgevoerd om de ovulatie in het verleden te bevestigen (observatie van het corpus luteum in een identieke eierstok, endometrium van ten minste 10 mm breed).

De patiënten werden geïnformeerd over de noodzaak om geslachtsgemeenschap op te geven in de cyclus waarin het onderzoek werd uitgevoerd, wat werd bevestigd in de onderzoeksdocumentatie. Patiënten die deze eis niet accepteerden, konden niet tot het onderzoek worden toegelaten. Tijdens het bezoek werd, nadat de ovulatie was bevestigd, een endometriumaspiratiebiopsie uitgevoerd met behulp van een plastic pipet met een diameter van ca. 3 mm (Pipelle endometriumzuigcurette). Als het moeilijk was om met een pipet het baarmoederhalskanaal binnen te dringen, werd de bovenlip van de baarmoederhals vastgeklemd met een klem. In het geval van ernstige pijn bij de patiënt of het onvermogen om het cervicale kanaal te penetreren, werd de verzameling van het materiaal stopgezet. Onmiddellijk na het onderzoek werd patiënten gevraagd om de pijnintensiteit tijdens de procedure numeriek te beoordelen op de numerieke beoordelingsschaal (NRS), waarbij 0 helemaal geen pijn is en 10 de ergst denkbare pijn. Bij geen van de patiënten deden zich complicaties voor. Het verzamelde endometriummonster werd bewaard in een oplossing van 10% neutrale, gebufferde formaline bij kamertemperatuur en vervolgens overgebracht naar de CMUJ Clinical and Experimental Pathology Department voor fixatie in paraffineblokken.

Op dezelfde dag werd bij elke patiënt een veneus bloedmonster van 5 ml op EDTA afgenomen. Het bloed werd gedurende 15 minuten bij 3000 rpm gecentrifugeerd en het serum werd naar de afdeling Klinische Biochemie van het Jagiellonian University Medical College gestuurd voor de bepaling van IL-18- en histamineniveaus.

Immunohistochemie Weefselmateriaal werd 24 uur in formaldehyde gefixeerd. Daarna werd het gedehydrateerd in 70% ethanoloplossing en vervolgens ingebed in paraffine. Weefsels werden in coupes van 4 µm dik gesneden en op gesilaniseerde objectglaasjes geplaatst. De secties werden verdeeld in drie gelijke sets. Paraffinepreparaten werden van was ontdaan (3 xyleenuitwisselingen bij kamertemperatuur; de eerste uitwisseling - 10 minuten, de tweede en derde uitwisseling na 15 minuten) en opnieuw gehydrateerd (3 alcoholuitwisselingen bij kamertemperatuur, elk 5 minuten). Vervolgens werden de preparaten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. in een 3% H2O2-oplossing om endogene peroxidase te blokkeren. Objectglaasjes werden gespoeld in gedestilleerd water en 5 minuten geïncubeerd met TBS. Vervolgens werden de objectglaasjes ontmaskerd met citraatbuffer pH 6,0 in een waterbad van 97°C. Nadat de preparaten waren ontmaskerd, werd het Ultra Vision Protein Block-preparaat (Thermo Scientific) gedurende 5 minuten aangebracht. bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Vervolgens werd het juiste antilichaam aangebracht en gedurende een bepaalde tijd bij kamertemperatuur in een vochtige kamer geïncubeerd (tabel 1). De eerste reeks secties werd geïncubeerd met IL-18-reactieve polyklonale konijnenantilichamen (Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. nr. PAA064HU01) bij een verdunning van 1:00 gedurende 60 min. De tweede set werd geïncubeerd met histamine-reactieve polyklonale konijnenantilichamen (Recombinant humaan histamine (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, catalogusnr. PAA927Ge01) bij een verdunning van 1:100 gedurende 30 min. De derde set werd geïncubeerd met polyklonale konijnenantilichamen (Recombinant humaan GLUT4 (Metl ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., catalogusnr. PAC023HU01) bij een verdunning van 1:50 gedurende 30 min. Overmaat antilichaam werd gewassen met TBS-buffer en Post-antilichaamblokkering voor Bright Vision plus (BrightVision + Geit anti-muis / konijn HRP - ImmunoLogic-kit) werd aangebracht. We incuberen in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.

Overmaat reagens werd weggewassen met TBS-buffer en een poly-HRP-GAMs/Rb IgG-preparaat (BrightVision + Goat anti-muis/konijn HRP - ImmunoLogic-kit) werd aangebracht. Geïncubeerd bij kamertemperatuur in een vochtige kamer gedurende 30 minuten. Overmaat reagens werd weggewassen met TBS-buffer en DAB Quanto (Thermo Scientific) werd aangebracht. Geïncubeerd bij kamertemperatuur in een vochtige kamer gedurende ongeveer 5 minuten. Vervolgens werd de overtollige reagens gespoeld met gedestilleerd water en werden de glaasjes gekleurd met hematoxyline (Thermo Scientific). De preparaten werden gedehydrateerd door een reeks van drie wisselingen van alcohol en xyleen in toenemende concentraties uit te voeren. Gesloten met een dekglaasje (CYTOSEAL van ThermoScientific). Expressie van elk cytokine werd semi-kwantitatief beoordeeld als het aantal positieve cellen per vierkante millimeter in het geanalyseerde monster, berekend met behulp van een beeldanalysator.

IL-18 en histamine in het bloed Serum IL-18-meting werd uitgevoerd door ELISA met behulp van humaan recombinant IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, catalogusnr. Orb50153). Bloedmonsters en reagentia werden opgewarmd tot 37 ° C en vervolgens 1: 2 verdund met het verdunningsmiddel met behulp van 50 μL buffer met volledige en uniforme menging. De oplossing werd in een hoeveelheid van 0,1 ml per putje gedoseerd. De microliterplaat met de putjes werd afgedekt met een deksel en gedurende 90 minuten bij 37°C geïncubeerd. De plaat werd vervolgens gedroogd, 0,1 ml gebiotinyleerde anti-menselijke IL-18-antilichaamoplossing werd aan elk putje toegevoegd en gedurende 60 minuten bij 37°C geïncubeerd. De plaat werd vervolgens driemaal gewassen in 0,01 M TBS (TRIS-gebufferde zoutoplossing), waarbij de wasbuffer telkens 1 minuut in het putje werd gelaten. De buffer werd verwijderd en de plaat werd gedroogd, vervolgens werd 0,1 ml bereide avidine-biotine-peroxidase (ABC)-oplossing aan elk putje toegevoegd en de plaat werd gedurende 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. De plaat werd opnieuw gespoeld, dit keer 5 keer met 0,01 M TBS, en de wasbuffer werd elke keer 1-2 minuten in de putjes gelaten. De buffer werd verwijderd en de plaat werd gedroogd, vervolgens werd 90 µl TMB-kleurstof aan elk putje toegevoegd en de plaat werd gedurende 10 minuten bij 37°C geïncubeerd. Aan elk putje werd 0,1 ml TMB-contrastkleurstofoplossing toegevoegd en de absorptie werd onmiddellijk gemeten bij 450 nm. Serum histamine niveaus werden gemeten door ELISA met behulp van het Histamine ELISA Immundiagnostik reagens, catalogusnummer K 8212. Het wasbufferconcentraat (WASHBUF B) werd 1:10 verdund in zuiver water. Reagentia werden op kamertemperatuur gebracht. De plasmamonsters werden gemengd met het derivatiseringsreagens. Het gederivatiseerde monster werd vervolgens samen met een met peroxidase gemerkt polyklonaal histamine-antilichaam op een met histaminederivaat beklede ELISA-plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd op een horizontaal schudapparaat. Vervolgens werd de inhoud van de putjes 5 keer gewassen met 250 µl van de wasbuffer. Na de laatste stap werd resterende buffer verwijderd met tissuepapier. Vervolgens werd 100 μl substraat (SUB) in elk putje gepipetteerd, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd, beschermd tegen licht. Aan elk putje werd 100 µl van de contrastkleurstofoplossing toegevoegd. De absorptie werd direct gemeten bij 450 nm. De resultaten worden uitgedrukt in picogrammen per milliliter.

Statistische analyse. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het programma Statistica (StatSoft 13.3). De Shapiro-Wilk normaliteitstest van de onderzochte variabelen en de gepresenteerde frequentiegrafieken toonden aan dat de verdeling van de variabelen niet normaal was. De niet-parametrische Wald-Wolfowitz- en U Mann-Whitney-tests werden gebruikt om de onderzoeksgroep te vergelijken met de controlegroep. De significantietoets van de correlatiecoëfficiënt was gebaseerd op de statistieken voor de Student's t-verdeling.