Провоспалительные цитокины и процесс имплантации у женщин с первичным идиопатическим бесплодием

Бесплодие затрагивает примерно от 8 до 12% пар репродуктивного возраста во всем мире, что эквивалентно более чем 186 миллионам человек.

Примерно у 20% пар возбудитель бесплодия не может быть идентифицирован после обычных диагностических тестов. Одной из причин идиопатического бесплодия могут быть нарушения имплантационного процесса.

Имплантация может происходить в определенный момент менструального цикла, когда способность бластоцисты к имплантации перекрывается с готовностью к ее принятию эндометрием, так называемая рецептивность эндометрия.

Интервал времени, в течение которого эндометрий проявляет это свойство, называется окном имплантации.

Имплантационное окно у человека составляет период от 3 до 6 дней, он приходится на половину секреторной фазы, то есть через 6-10 дней после пика ЛГ.

Приобретение рецептивности эндометрием отражается в клеточных и структурных изменениях.

Процессы гормонально контролируются эстрогенами и прогестероном яичникового происхождения. Кроме того, важное значение имеют локально продуцируемые сигнальные молекулы, такие как цитокины, факторы роста и липидные медиаторы, посредством аутокринной, паракринной и юкстакринной передачи сигналов.

Генетически восприимчивые и решающие управляются гомеобоксными генами Hoxa10 и Hoxa11, экспрессия которых увеличивается под действием стероидных гормонов. Изменения на клеточном и молекулярном уровнях в эндометрии сравнивают с такими процессами, как заживление ран и деградация матрикса в процессе инвазии рака.

Среди клеток иммунной системы, инфильтрирующих эндометрий, преобладают мононуклеарные клетки: макрофаги, лимфоциты и NK-клетки.

При рассмотрении роли местного воспаления в фертильности важно различать острое и хроническое воспаление средней или низкой интенсивности.

В острой фазе воспалительного ответа клетки иммунной системы мигрируют к месту повреждения в тщательно спланированной последовательности событий, чему способствуют растворимые медиаторы, такие как цитокины, хемокины и белки острой фазы. В зависимости от серьезности травмы этой острой фазы может быть достаточно для восстановления повреждения и запуска процессов заживления.

Продолжительное воспаление в результате длительного воздействия стимуляции или неадекватной реакции на собственные ткани может привести к хронической фазе, в которой может произойти повреждение тканей и фиброз.

Профиль молекул, наблюдаемых при данном воспалении, зависит от тяжести, продолжительности и механизмов, вовлеченных в процесс воспаления, а также от способности иммунной системы организма реагировать и адаптироваться.

Целью исследования было выяснить, отличаются ли уровни выбранных воспалительных молекул - интерлейкина-18 и гистамина в популяции женщин с неустановленным бесплодием по сравнению с женщинами с естественным зачатием потомства.

Материалы и методы Было проведено проспективное перекрестное исследование. Дизайн исследования получил положительное заключение Комитета по биоэтике Ягеллонского университета № 1072.6120.78.2017 от 29 июня 2017 г. Средства получены из гранта № K/DSC/00421 Министерства науки и высшего образования. Основную группу составили 58 женщин с диагнозом «первичное бесплодие», а контрольную группу составили 8 пациенток с естественным зачатием потомства. Пациентки были набраны из числа женщин, госпитализированных в Клинику гинекологической эндокринологии и гинекологии, консультированных в Клинике гинекологической эндокринологии и продиагностированных в рамках Комплексной программы репродуктивного здоровья в период с ноября 2017 года по март 2020 года.

Критериям включения в исследуемую группу соответствовали женщины репродуктивного возраста (18-40 лет), страдающие первичным бесплодием (безуспешно пытающиеся забеременеть более года), имеющие регулярные менструации, не применяющие гормональную терапию.

Критериями исключения были: установленный мужской фактор бесплодия, трубный фактор, эндометриоз, воспалительные процессы в области малого таза - в настоящее время и в анамнезе, гормональный фон бесплодия, ожирение, инсулинорезистентность, статус как минимум после одного невынашивания беременности и хронические аутоиммунные заболевания.

Критериям включения в контрольную группу соответствовали пациентки репродуктивного возраста (18-40 лет), имеющие естественно зачатое потомство в возрасте до трех лет, с регулярными менструациями. Критериями исключения являлись: состояние после операции на матке, в том числе выскабливания полости матки, эндометриоз, воспаление органов малого таза в наличии и в анамнезе, не менее одного невынашивания беременности, ожирение, инсулинорезистентность, хронические аутоиммунные заболевания, кормление грудью.

Пациенты обеих групп, включенные в исследование, были обследованы в период имплантационного окна. Подходящее время цикла определяли с помощью ультразвукового мониторинга овуляции. Пациенты сообщали, что примерно на 10-й день цикла наблюдали рост доминантного фолликула. Обследование повторяют через 3-4 дня. В случае подтверждения роста доминантного фолликула пациентка выполняла анализ мочи на ЛГ дома за 16 дней до предполагаемого начала менструации. Пациентки сообщали через 6-8 дней после пика ЛГ или, в случае сомнительного результата теста, в середине лютеиновой фазы, определяемой сообщаемой продолжительностью менструальных циклов, - за 8-4 дня до дня ожидаемой менструации. Во время визита было проведено ультразвуковое исследование для подтверждения прошедшей овуляции (наблюдение за желтым телом в идентичном яичнике, эндометрий шириной не менее 10 мм).

Пациентки были проинформированы о необходимости отказа от половых контактов в цикле, в котором проводилось исследование, что было подтверждено документацией исследования. Пациенты, не принявшие это требование, не могли быть допущены к исследованию. Во время визита после подтверждения овуляции была проведена аспирационная биопсия эндометрия с помощью пластиковой пипетки диаметром ок. 3 мм (Кюретка для аспирации эндометрия Pipelle). При затруднении проникновения пипеткой в ​​цервикальный канал верхнюю губу шейки матки зажимали зажимом. В случае сильных болей у пациентки или невозможности проникнуть в цервикальный канал забор материала прекращали. Сразу после обследования пациентов просили оценить интенсивность боли во время процедуры численно по числовой оценочной шкале (NRS), где 0 — полное отсутствие боли, а 10 — самая сильная боль, какую только можно себе представить. Осложнений ни у одного из пациентов не было. Собранный образец эндометрия сохраняли в растворе 10% нейтрального забуференного формалина при комнатной температуре, а затем передавали в отделение клинической и экспериментальной патологии CMUJ для фиксации в парафиновых блоках.

В тот же день у каждого пациента был взят образец венозной крови на ЭДТА объемом 5 мл. Кровь центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин и сыворотку направляли на кафедру клинической биохимии Медицинского колледжа Ягеллонского университета для определения уровня ИЛ-18 и гистамина.

Иммуногистохимия Тканевый материал фиксировали в формальдегиде в течение 24 часов. Затем его обезвоживали в 70% растворе этанола и затем заливали в парафин. Ткани делали срезы толщиной 4 мкм и помещали на силанизированные предметные стекла. Секции были разделены на три равные группы. Парафиновые препараты депарафинизировали (3 ксилольных обмена при комнатной температуре; первая замена - 10 мин, вторая и третья замена через 15 мин) и регидратировали (3 спиртовых обмена при комнатной температуре по 5 мин). Затем препараты инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. в 3% растворе H2O2 для блокирования эндогенной пероксидазы. Предметные стекла промывали дистиллированной водой и инкубировали с TBS в течение 5 минут. Затем препараты демаскировали цитратным буфером рН 6,0 на водяной бане при 97°С. После демаскирования препаратов наносили препарат Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific) на 5 мин. при комнатной температуре во влажной камере. Затем наносили соответствующие антитела и инкубировали при комнатной температуре во влажной камере в течение заданного времени (табл. 1). Первый набор срезов инкубировали с кроличьими поликлональными антителами, реактивными к IL-18 (Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 мг/мл кат. № PAA064HU01) в разведении 1:00 в течение 60 мин. Второй набор инкубировали с кроличьими поликлональными антителами, реагирующими с гистамином (Рекомбинантный человеческий гистамин (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 мг/мл, № по каталогу PAA927Ge01) в разведении 1:100 в течение 30 мин. Третий набор инкубировали с кроличьими поликлональными антителами (рекомбинантный человеческий GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., № по каталогу PAC023HU01) в разведении 1:50 на 30 мин. Избыток антител промывали буфером TBS и применяли последующее блокирование антителами для Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-mouse / Rabbit HRP - ImmunoLogic kit). Инкубируем во влажной камере при комнатной температуре 20 минут.

Избыток реагента смывали буфером TBS и наносили препарат поли-HRP-GAMs/Rb IgG (BrightVision + Goat anti-mouse/ rabbit HRP - ImmunoLogic kit). Инкубируют при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 минут. Избыток реагента смывали буфером TBS и наносили DAB Quanto (Thermo Scientific). Инкубируют при комнатной температуре во влажной камере в течение примерно 5 минут. Затем излишки реагента смывали дистиллированной водой и окрашивали предметные стекла гематоксилином (Thermo Scientific). Препараты обезвоживали, проводя серию из трех смен спирта и ксилола в возрастающих концентрациях. Закрывают покровным стеклом (CYTOSEAL от ThermoScientific). Экспрессию каждого цитокина оценивали полуколичественно как количество положительных клеток на квадратный миллиметр в анализируемом образце, рассчитанное с использованием анализатора изображений.

IL-18 и гистамин в крови Измерение IL-18 в сыворотке выполняли с помощью ELISA с использованием человеческого рекомбинантного IL-18 (набор для ELISA для человеческого IL-18, Biorbyt, № по каталогу Орб50153). Образцы крови и реагенты нагревали до 37°С и затем разбавляли 1:2 разбавителем с использованием 50 мкл буфера при полном и равномерном перемешивании. Раствор дозировали по 0,1 мл на лунку. Микропланшет с лунками накрывали крышкой и инкубировали при 37°С в течение 90 мин. Затем планшет высушивали, в каждую лунку добавляли 0,1 мл раствора биотинилированного антитела против человеческого IL-18 и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Затем планшет трижды промывали 0,01 М раствором TBS (трис-буферный раствор), каждый раз оставляя промывочный буфер в лунке на 1 мин. Буфер удаляли и планшет высушивали, затем в каждую лунку добавляли по 0,1 мл приготовленного раствора авидин-биотин-пероксидазы (АВС) и инкубировали планшет при 37°С в течение 30 мин. Планшет снова промывали, на этот раз 5 раз 0,01 М ТБС, и каждый раз промывочный буфер оставляли в лунках на 1-2 мин. Буфер удаляли и планшет высушивали, затем в каждую лунку добавляли по 90 мкл красителя ТМВ и инкубировали планшет при 37°С в течение 10 мин. В каждую лунку добавляли 0,1 мл раствора контрастного красителя ТМВ и сразу же измеряли оптическую плотность при 450 нм. Уровни гистамина в сыворотке измеряли с помощью ELISA с использованием реагента Histamin ELISA Immundiagnostik, каталожный номер K 8212. Концентрат промывочного буфера (WASHBUF B) разводили 1:10 в чистой воде. Реагенты доводили до комнатной температуры. Образцы плазмы смешивали с дериватизирующим реагентом. Затем дериватизированный образец инкубировали на горизонтальном шейкере вместе с меченым пероксидазой поликлональным антителом к ​​гистамину на покрытом производным гистамина планшете для ELISA в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем содержимое лунок промывали 5 раз по 250 мкл промывочного буфера. После последнего этапа остатки буфера удаляли папиросной бумагой. Затем в каждую лунку пипеткой вносили по 100 мкл субстрата (СУБ), инкубировали 15 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. В каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора контрастного красителя. Поглощение измеряли сразу при 450 нм. Результаты выражают в пикограммах на миллилитр.

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica (StatSoft 13.3). Критерий нормальности Шапиро-Уилка исследуемых переменных и представленные графики частот показали, что распределение переменных не было нормальным. Для сравнения исследуемой группы с контрольной группой использовали непараметрические критерии Вальда-Вольфовица и U-критерия Манна-Уитни. Критерий значимости коэффициента корреляции был основан на статистике t-распределения Стьюдента.