Cytokiny prozapalne a proces implantacji u kobiet z pierwotną idiopatyczną niepłodnością

Niepłodność dotyka około 8 do 12% par w wieku rozrodczym na całym świecie, co odpowiada ponad 186 milionom ludzi.

U około 20% par po rutynowych badaniach diagnostycznych nie udaje się ustalić czynnika sprawczego niepłodności. Jedną z przyczyn niepłodności idiopatycznej mogą być zaburzenia procesu implantacji.

Implantacja może nastąpić w określonym momencie cyklu miesiączkowego, kiedy zdolność blastocysty do implantacji nakłada się na gotowość do jej przyjęcia przez endometrium, tzw. receptywność endometrium.

Przedział czasu, w którym endometrium wykazuje tę właściwość, nazywany jest oknem implantacyjnym.

Okno implantacyjne u ludzi to okres od 3 do 6 dni, przypada na połowę fazy wydzielniczej – czyli 6 do 10 dni po piku LH.

Nabycie receptywności przez endometrium znajduje odzwierciedlenie w zmianach komórkowych i strukturalnych.

Procesy te są hormonalnie kontrolowane przez estrogeny i progesteron pochodzenia jajnikowego. Ponadto ważne są wytwarzane lokalnie cząsteczki sygnałowe, takie jak cytokiny, czynniki wzrostu i mediatory lipidowe, za pośrednictwem sygnalizacji autokrynnej, parakrynnej i oboktakrynowej.

Genetycznie receptywne i decydujące są napędzane przez geny homeobox Hoxa10 i Hoxa11, których ekspresja jest zwiększona przez działanie hormonów steroidowych. Zmiany na poziomie komórkowym i molekularnym w obrębie endometrium są porównywane z procesami takimi jak gojenie się ran i degradacja macierzy podczas procesu inwazji raka.

Wśród komórek układu immunologicznego naciekających błonę śluzową macicy dominują komórki jednojądrzaste: makrofagi, limfocyty i komórki NK.

Rozważając rolę miejscowego stanu zapalnego w płodności, istotne jest rozróżnienie ostrego i przewlekłego stanu zapalnego o umiarkowanym lub małym nasileniu.

W ostrej fazie odpowiedzi zapalnej komórki układu odpornościowego migrują do miejsca urazu w starannie zaplanowanej sekwencji zdarzeń, wspomaganej rozpuszczalnymi mediatorami, takimi jak cytokiny, chemokiny i białka ostrej fazy. W zależności od ciężkości urazu, ta ostra faza może wystarczyć do naprawy uszkodzeń i zainicjowania procesów gojenia.

Przedłużający się stan zapalny, w wyniku długotrwałej ekspozycji na stymulację lub niewłaściwej reakcji wobec własnych tkanek, może doprowadzić do fazy przewlekłej, w której może dojść do uszkodzenia tkanek i zwłóknienia.

Profil cząsteczek obserwowanych w danym zapaleniu zależy od ciężkości, czasu trwania i mechanizmów zaangażowanych w proces zapalny, a także zdolności układu odpornościowego organizmu do reagowania i adaptacji.

Celem pracy było zbadanie, czy poziom wybranych cząsteczek zapalnych – interleukiny18 i histaminy, różni się w populacji kobiet z nieustaloną niepłodnością w porównaniu z kobietami, które urodziły potomstwo w sposób naturalny.

Materiały i metody Przeprowadzono prospektywne, przekrojowe badanie. Projekt badania uzyskał pozytywną opinię Komisji Bioetycznej UJ nr 1072.6120.78.2017 z dnia 29 czerwca 2017 r. Środki pozyskano z grantu nr K/DSC/00421 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Grupę badaną stanowiło 58 kobiet z rozpoznaną niepłodnością pierwotną, a grupę kontrolną 8 pacjentek z potomstwem poczętym naturalnie. Pacjentki rekrutowano spośród kobiet hospitalizowanych w Klinice Endokrynologii i Ginekologii Ginekologicznej, konsultowanych w Klinice Endokrynologii Ginekologicznej oraz diagnozowanych w ramach Kompleksowego Programu Zdrowia Reprodukcyjnego w okresie od listopada 2017 do marca 2020 roku.

Kryteria włączenia do badanej grupy spełniały kobiety w wieku rozrodczym (18-40 lat), cierpiące na pierwotną niepłodność (od ponad roku bezskutecznie usiłujące zajść w ciążę), regularnie miesiączkujące, niestosujące terapii hormonalnej.

Kryteriami wykluczającymi były: stwierdzony męski czynnik niepłodności, czynnik jajowodowy, endometrioza, stan zapalny w obrębie miednicy mniejszej – obecnie iw przeszłości, hormonalne podłoże niepłodności, otyłość, insulinooporność, stan po co najmniej jednym poronieniu oraz przewlekłe choroby autoimmunologiczne.

Kryteria włączenia do grupy kontrolnej spełniały pacjentki w wieku rozrodczym (18-40 lat) z naturalnie poczętym potomstwem do trzeciego roku życia, z regularnymi miesiączkami. Kryteriami wykluczenia były: stan po operacji macicy, w tym wyłyżeczkowanie jamy macicy, endometrioza, zapalenie miednicy mniejszej – obecne iw wywiadzie co najmniej jedno poronienie, otyłość, insulinooporność, przewlekłe choroby autoimmunologiczne, karmienie piersią.

Pacjenci z obu grup rekrutowanych do badania byli badani w oknie implantacyjnym. Właściwy czas cyklu określono na podstawie ultrasonograficznego monitorowania owulacji. Pacjenci zgłaszali się około 10. dnia cyklu, aby obserwować wzrost dominującego pęcherzyka. Badanie powtórzono po 3-4 dniach. W przypadku potwierdzenia dominującego wzrostu pęcherzyka pacjentka wykonywała w domu oznaczenie LH w moczu na 16 dni przed spodziewanym wystąpieniem miesiączki. Pacjentki zgłaszały się 6-8 dni po piku LH lub w przypadku wątpliwego wyniku testu w połowie fazy lutealnej określonej na podstawie zgłaszanej długości cykli miesięcznych - 8-4 dni przed dniem spodziewanej miesiączki. Podczas wizyty wykonano badanie USG w celu potwierdzenia przebytej owulacji (obserwacja ciałka żółtego w identycznym jajniku, endometrium o szerokości co najmniej 10 mm).

Pacjentki zostały poinformowane o konieczności rezygnacji ze współżycia w cyklu, w którym przeprowadzono badanie, co zostało potwierdzone w dokumentacji badania. Pacjenci, którzy nie akceptowali tego wymogu, nie mogli być dopuszczeni do badania. Podczas wizyty, po potwierdzeniu owulacji, wykonano biopsję aspiracyjną endometrium za pomocą plastikowej pipety o średnicy ok. 3 mm (kireta do odsysania endometrium Pipelle). W przypadku trudności z penetracją kanału szyjki macicy za pomocą pipety chwytano zaciskiem górną wargę szyjki macicy. W przypadku silnego bólu u pacjentki lub braku możliwości penetracji kanału szyjki macicy przerywano pobieranie materiału. Bezpośrednio po badaniu pacjenci byli proszeni o liczbową ocenę nasilenia bólu podczas zabiegu na numerycznej skali ocen (NRS), gdzie 0 oznacza całkowity brak bólu, a 10 ból najgorszy, jaki można sobie wyobrazić. U żadnego z pacjentów nie wystąpiły powikłania. Pobrany wycinek endometrium zakonserwowano w 10% roztworze obojętnej, buforowanej formaliny w temperaturze pokojowej, a następnie przekazano do Zakładu Patologii Klinicznej i Doświadczalnej CMUJ w celu utrwalenia w bloczkach parafinowych.

Tego samego dnia od każdego pacjenta pobrano 5 ml krwi żylnej na EDTA. Krew odwirowywano przez 15 minut przy 3000 obr./min, a surowicę przesłano do Zakładu Biochemii Klinicznej CM UJ w celu oznaczenia poziomu IL-18 i histaminy.

Immunohistochemia Materiał tkankowy utrwalano w formaldehydzie przez 24 godziny. Następnie odwodniono ją w 70% roztworze etanolu, a następnie zatopiono w parafinie. Tkanki pocięto na skrawki o grubości 4 µm i osadzono na silanizowanych szkiełkach. Sekcje podzielono na trzy równe zestawy. Preparaty parafinowe odparafinowano (3 wymiany ksylenu w temperaturze pokojowej; pierwsza wymiana - 10 minut, druga i trzecia wymiana po 15 minutach) i ponownie uwodniono (3 wymiany alkoholu w temperaturze pokojowej, każda po 5 minut). Następnie preparaty inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min. w 3% roztworze H2O2 w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Szkiełka płukano w wodzie destylowanej i inkubowano z TBS przez 5 minut. Następnie szkiełka odmaskowano buforem cytrynianowym pH 6,0 w łaźni wodnej o temperaturze 97°C. Po demaskacji preparatów na 5 min nakładano preparat Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific). w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Następnie nanoszono odpowiednie przeciwciało i inkubowano w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez określony czas (Tabela 1). Pierwszy zestaw skrawków inkubowano z reaktywnymi króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi IL-18 (Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Kat. nr PAA064HU01) w rozcieńczeniu 1:00 przez 60 min. Drugi zestaw inkubowano z króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi reagującymi z histaminą (Recombinant human histamine (Met1~Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, nr katalogowy. PAA927Ge01) w rozcieńczeniu 1:100 przez 30 min. Trzeci zestaw inkubowano z króliczymi przeciwciałami poliklonalnymi (Recombinant human GLUT4 (Met1~Ile163) Cloud-Clone Corp., nr katalogowy. PAC023HU01) w rozcieńczeniu 1:50 przez 30 min. Nadmiar przeciwciała przepłukano buforem TBS i zastosowano blokowanie po przeciwciałach dla Bright Vision plus (BrightVision + Goat antymysie/królicze HRP - zestaw ImmunoLogic). Inkubujemy w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Nadmiar odczynnika wypłukano buforem TBS i nałożono preparat poli-HRP-GAMs/Rb IgG (BrightVision + Goat anty-mysi/króliczy HRP – zestaw ImmunoLogic). Inkubowano w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez 30 minut. Nadmiar odczynnika wypłukano buforem TBS i zastosowano DAB Quanto (Thermo Scientific). Inkubowano w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze przez około 5 minut. Następnie nadmiar odczynnika spłukano wodą destylowaną i szkiełka zabarwiono hematoksyliną (Thermo Scientific). Preparaty odwadniano przeprowadzając serię trzech zmian alkoholu i ksylenu w rosnących stężeniach. Zamknięte szkiełkiem nakrywkowym (CYTOSEAL firmy ThermoScientific). Ekspresję każdej cytokiny oceniano półilościowo jako liczbę komórek dodatnich na milimetr kwadratowy w analizowanej próbce, obliczoną przy użyciu analizatora obrazu.

IL-18 i histamina we krwi Pomiar IL-18 w surowicy przeprowadzono metodą ELISA z użyciem ludzkiej rekombinowanej IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, nr katalog. Kula50153). Próbki krwi i odczynniki ogrzano do 37°C, a następnie rozcieńczono rozcieńczalnikiem 1:2 stosując 50 µl buforu przy całkowitym i równomiernym wymieszaniu. Roztwór dozowano po 0,1 ml na studzienkę. Płytkę mikrolitrową ze studzienkami przykryto pokrywką i inkubowano w temperaturze 37°C przez 90 min. Następnie płytkę wysuszono, do każdej studzienki dodano 0,1 ml roztworu biotynylowanego przeciwciała przeciw ludzkiej IL-18 i inkubowano w temperaturze 37°C przez 60 min. Płytkę następnie przemyto trzykrotnie w 0,01 M TBS (sól fizjologiczna buforowana TRIS), za każdym razem pozostawiając bufor do przemywania w studzience na 1 min. Bufor usunięto i płytkę wysuszono, następnie do każdej studzienki dodano 0,1 ml przygotowanego roztworu awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC) i płytkę inkubowano w 37°C przez 30 min. Płytkę ponownie przepłukano, tym razem 5 razy 0,01 M TBS, a bufor do przemywania pozostawiano w dołkach za każdym razem na 1-2 min. Bufor usunięto i płytkę wysuszono, następnie do każdej studzienki dodano 90 µl barwnika TMB i płytkę inkubowano w 37°C przez 10 min. Do każdej studzienki dodano 0,1 ml roztworu barwnika kontrastowego TMB i natychmiast zmierzono absorbancję przy 450 nm. Poziomy histaminy w surowicy mierzono metodą ELISA przy użyciu odczynnika Histamin ELISA Immundiagnostik, numer katalogowy K 8212. Koncentrat buforu do przemywania (WASHBUF B) rozcieńczono 1:10 w czystej wodzie. Odczynniki doprowadzono do temperatury pokojowej. Próbki osocza zmieszano z odczynnikiem do derywatyzacji. Następnie derywatyzowaną próbkę inkubowano na wytrząsarce poziomej razem ze znakowanym peroksydazą poliklonalnym przeciwciałem histaminowym na płytce ELISA powleczonej pochodną histaminy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zawartość studzienek przemyto 5 razy 250 µl buforu do płukania. Po ostatnim etapie pozostały bufor usunięto bibułką. Następnie do każdej studzienki odpipetowano 100 μl substratu (SUB), inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Do każdej studzienki dodano 100 µl roztworu barwnika kontrastowego. Absorbancję mierzono natychmiast przy 450 nm. Wyniki wyrażono w pikogramach na mililitr.

Analiza statystyczna. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Statistica (StatSoft 13.3). Test normalności Shapiro-Wilka badanych zmiennych oraz przedstawione wykresy częstości wykazały, że rozkłady zmiennych nie są normalne. Do porównania grupy badanej z grupą kontrolną zastosowano nieparametryczne testy Walda-Wolfowitza i U Manna-Whitneya. Test istotności współczynnika korelacji oparto na statystyce dla rozkładu t-Studenta.