Pro-inflammatoriske cytokiner og implantasjonsprosess hos kvinner med primær idiopatisk infertilitet

Infertilitet påvirker omtrent 8 til 12 % av par i reproduktiv alder over hele verden, tilsvarende mer enn 186 millioner mennesker.

Hos omtrent 20 % av parene kan ikke årsaken til infertilitet identifiseres etter rutinemessige diagnostiske tester. En av årsakene til idiopatisk infertilitet kan være forstyrrelser i implantasjonsprosessen.

Implantasjon kan finne sted på et spesifikt punkt i menstruasjonssyklusen, når blastocystens kapasitet til å implantere overlappes med beredskapen for dens aksept av endometriet, den såkalte endometriereseptiviteten.

Tidsintervallet der endometriet viser denne egenskapen kalles implantasjonsvinduet.

Implantasjonsvinduet hos mennesker er en periode på 3 til 6 dager, det faller på halvparten av sekretorfasen - det vil si 6 til 10 dager etter LH-toppen.

Ervervelsen av mottakelighet av endometrium gjenspeiles i cellulære og strukturelle endringer.

Prosessene styres hormonelt av østrogener og progesteron av eggstokkopprinnelse. I tillegg er lokalt produserte signalmolekyler som cytokiner, vekstfaktorer og lipidmediatorer via autokrin, parakrin og juxtakrin signalering viktig.

Genetisk mottakelige og avgjørende er drevet av Hoxa10 og Hoxa11 homeobox-genene, hvis uttrykk økes av virkningen av steroidhormoner. Endringer på cellulære og molekylære nivåer i endometrium sammenlignes med prosesser som sårheling og nedbrytning av matrisen under prosessen med kreftinvasjon.

Blant cellene i immunsystemet som infiltrerer endometriet, dominerer mononukleære celler: makrofager, lymfocytter og NK-celler.

Når man vurderer hvilken rolle lokal betennelse spiller i fertilitet, er det viktig å skille mellom akutt og kronisk betennelse av moderat eller lav intensitet.

I den akutte fasen av den inflammatoriske responsen migrerer celler i immunsystemet til skadestedet i en nøye planlagt sekvens av hendelser tilrettelagt av løselige mediatorer som cytokiner, kjemokiner og akuttfaseproteiner. Avhengig av alvorlighetsgraden av skaden kan denne akutte fasen være tilstrekkelig til å reparere skaden og sette i gang helbredelsesprosesser.

Langvarig betennelse, som følge av langvarig eksponering for stimulering eller en uhensiktsmessig respons mot eget vev, kan føre til en kronisk fase, hvor vevsskade og fibrose kan oppstå.

Profilen til molekylene som sees i en gitt betennelse avhenger av alvorlighetsgraden, varigheten og mekanismene som er involvert i betennelsesprosessen, samt evnen til kroppens immunsystem til å reagere og tilpasse seg.

Målet med studien var å undersøke om nivåene av utvalgte inflammatoriske molekyler - interleukin18 og histamin, er forskjellige i populasjonen av kvinner med ubestemt infertilitet sammenlignet med kvinner med naturlig unnfanget avkom.

Materialer og metoder Det ble gjennomført en prospektiv tverrsnittsstudie. Studiedesignet mottok en positiv uttalelse fra Bioethics Committee ved Jagiellonian University nr. 1072.6120.78.2017 datert 29. juni 2017 Midlene ble hentet fra stipend nr. K / DSC / 00421 fra departementet for vitenskap og høyere utdanning. Studiegruppen besto av 58 kvinner diagnostisert med primær infertilitet, og en kontrollgruppe besto av 8 pasienter med naturlig unnfanget avkom. Pasienter ble rekruttert blant kvinner innlagt på sykehus ved Gynecological Endocrinology and Gynecology Clinic, konsultert ved Gynecological Endocrinology Clinic og diagnostisert under Comprehensive Reproductive Health Program i perioden fra november 2017 til mars 2020.

Inklusjonskriteriene for studiegruppen ble oppfylt av kvinner i reproduktiv alder (18-40 år) som led av primær infertilitet (forsøkte ikke å bli gravid i mer enn ett år uten hell), menstruerte regelmessig, ikke bruker hormonbehandling.

Eksklusjonskriteriene var: etablert mannlig faktor for infertilitet, tubal faktor, endometriose, betennelse i bekkenområdet - for tiden og i historien, hormonell bakgrunn for infertilitet, fedme, insulinresistens, status etter minst en spontanabort og kroniske autoimmune sykdommer.

Inklusjonskriteriene for kontrollgruppen ble oppfylt av pasienter i reproduktiv alder (18-40 år) med naturlig unnfanget avkom opp til tre år, med regelmessig menstruasjon. Eksklusjonskriteriene var: tilstand etter operasjon av livmoren, inkludert curettage av livmorhulen, endometriose, bekkenbetennelse - nåværende og i historien, minst én spontanabort, overvekt, insulinresistens, kroniske autoimmune sykdommer, amming.

Pasienter fra begge gruppene som ble rekruttert til studien ble undersøkt under implantasjonsvinduet. Det riktige tidspunktet for syklusen ble bestemt ved hjelp av eggløsningsovervåking med ultralyd. Pasienter rapporterte rundt dag 10 i syklusen for å observere veksten av den dominerende follikkelen. Undersøkelsen ble gjentatt etter 3-4 dager. Hvis den dominerende follikkelveksten ble bekreftet, utførte pasienten en urin LH-test hjemme 16 dager før forventet menstruasjonsstart. Pasienter rapporterte 6-8 dager etter LH-toppen eller, ved tvilsom testresultat, midt i lutealfasen bestemt av den rapporterte lengden på menstruasjonssyklusene - 8-4 dager før dagen for forventet menstruasjon. Under besøket ble det utført en ultralydundersøkelse for å bekrefte tidligere eggløsning (observasjon av corpus luteum i en identisk eggstokk, endometrium minst 10 mm bredt).

Pasientene ble informert om nødvendigheten av å gi opp samleie i den syklusen studien ble utført i, noe som ble bekreftet i studiedokumentasjonen. Pasienter som ikke godtok dette kravet kunne ikke bli tatt opp i studien. Under besøket, etter at eggløsning var bekreftet, ble det utført endometrieaspirasjonsbiopsi ved bruk av en plastpipette med en diameter på ca. 3 mm (Pipelle Endometrial Suge Curette). Hvis det var vanskeligheter med å penetrere livmorhalskanalen med en pipette, ble overleppen av livmorhalsen grepet med en klemme. Ved sterke smerter hos pasienten eller manglende evne til å penetrere livmorhalskanalen, ble innsamlingen av materialet avbrutt. Umiddelbart etter undersøkelsen ble pasientene bedt om å vurdere smerteintensiteten under prosedyren numerisk på den numeriske vurderingsskalaen (NRS), der 0 er ingen smerte i det hele tatt og 10 er den verste smerten man kan tenke seg. Det var ingen komplikasjoner hos noen av pasientene. Den innsamlede endometrieprøven ble konservert i en løsning av 10 % nøytral, bufret formalin ved romtemperatur, og deretter overført til CMUJ Clinical and Experimental Pathology Department for fiksering i parafinblokker.

Samme dag ble det tatt en 5 ml venøs blodprøve på EDTA fra hver pasient. Blodet ble sentrifugert i 15 minutter ved 3000 rpm, og serumet ble sendt til Institutt for klinisk biokjemi ved Jagiellonian University Medical College for bestemmelse av IL-18- og histaminnivåer.

Immunhistokjemi Vevsmateriale ble fiksert i formaldehyd i 24 timer. Deretter ble den dehydrert i 70% etanolløsning og deretter innleiret i parafin. Vev ble snittet 4 µm tykt og montert på silaniserte objektglass. Seksjonene ble delt inn i tre like sett. Parafinpreparater ble avvokset (3 xylenutvekslinger ved romtemperatur; den første utvekslingen - 10 minutter, den andre og tredje utvekslingen etter 15 minutter) og rehydrert (3 alkoholutvekslinger ved romtemperatur, 5 minutter hver). Deretter ble preparatene inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. i en 3 % H2O2-løsning for å blokkere endogen peroksidase. Objektglassene ble skylt i destillert vann og inkubert med TBS i 5 minutter. Deretter ble objektglassene demaskert med sitratbuffer pH 6,0 i et vannbad ved 97 ° C. Etter at preparatene var avmaskert, ble Ultra Vision Protein Block-preparatet (Thermo Scientific) påført i 5 min. ved romtemperatur i et fuktig kammer. Deretter ble det passende antistoffet påført og inkubert ved romtemperatur i et fuktig kammer i en spesifisert tid (tabell 1). Det første settet med seksjoner ble inkubert med IL-18 reaktive polyklonale kaninantistoffer (Rekombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Kat. nr. PAA064HU01) ved en fortynning på 1:00 i 60 min. Det andre settet ble inkubert med histaminreaktive polyklonale kaninantistoffer (rekombinant humant histamin (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, katalognr. PAA927Ge01) ved en fortynning på 1:100 i 30 min. Det tredje settet ble inkubert med polyklonale kaninantistoffer (Rekombinant humant GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., katalognr. PAC023HU01) ved en fortynning på 1:50 i 30 min. Overskudd av antistoff ble vasket med TBS-buffer og Post-antistoffblokkering for Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-mus / kanin HRP - ImmunoLogic kit) ble påført. Vi inkuberer i et fuktig kammer ved romtemperatur i 20 minutter.

Overskudd av reagens ble vasket av med TBS-buffer og et poly-HRP-GAMs / Rb IgG-preparat (BrightVision + Goat anti-mus / kanin HRP - ImmunoLogic-sett) ble påført. Inkubert ved romtemperatur i et fuktig kammer i 30 minutter. Overskudd av reagens ble vasket av med TBS-buffer og DAB Quanto (Thermo Scientific) ble påført. Inkubert ved romtemperatur i et fuktig kammer i ca. 5 minutter. Deretter ble overskuddet av reagens skylt med destillert vann og objektglassene ble farget med hematoxylin (Thermo Scientific). Preparatene ble dehydrert ved å utføre en serie på tre endringer av alkohol og xylen i økende konsentrasjoner. Lukket med et dekkglass (CYTOSEAL av ThermoScientific). Ekspresjon av hvert cytokin ble vurdert semikvantitativt som antall positive celler per kvadratmillimeter i den analyserte prøven, beregnet ved bruk av en bildeanalysator.

IL-18 og histamin i blodet Serum IL-18-måling ble utført ved ELISA ved bruk av human rekombinant IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, katalognr. Orb50153). Blodprøver og reagenser ble varmet opp til 37 °C og deretter fortynnet 1:2 med fortynningsvæsken ved bruk av 50 µL buffer med fullstendig og jevn blanding. Løsningen ble dispensert 0,1 ml per brønn. Mikroliterplaten med brønnene ble dekket med et lokk og inkubert ved 37°C i 90 minutter. Platen ble deretter tørket, 0,1 ml biotinylert anti-human IL-18 antistoffløsning ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37°C i 60 minutter. Platen ble deretter vasket tre ganger i 0,01 M TBS (TRIS bufret saltvann), hver gang vaskebufferen ble liggende i brønnen i 1 min. Bufferen ble fjernet og platen ble tørket, deretter ble 0,1 ml fremstilt avidin-biotin-peroksidase (ABC)-løsning tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. Platen ble skylt igjen, denne gangen 5 ganger med 0,01 M TBS, og vaskebufferen ble liggende i brønnene i 1-2 minutter hver gang. Bufferen ble fjernet og platen ble tørket, deretter ble 90 ul TMB fargestoff tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert ved 37°C i 10 minutter. 0,1 ml TMB kontrastfargeløsning ble tilsatt til hver brønn og absorbansen ble umiddelbart målt ved 450 nm. Serumhistaminnivåer ble målt ved ELISA ved bruk av Histamin ELISA Immundiagnostik-reagens, katalognummer K 8212. Vaskebufferkonsentratet (WASHBUF B) ble fortynnet 1:10 i rent vann. Reagenser ble brakt til romtemperatur. Plasmaprøvene ble blandet med derivatiseringsreagenset. Den derivatiserte prøven ble deretter inkubert på en horisontal rister sammen med et peroksidasemerket polyklonalt histaminantistoff på en histaminderivatbelagt ELISA-plate i 1 time ved romtemperatur. Deretter ble innholdet i brønnene vasket 5 ganger med 250 ul av vaskebufferen. Etter det siste trinnet ble gjenværende buffer fjernet med silkepapir. Deretter ble 100 μl substrat (SUB) pipettert i hver brønn, inkubert i 15 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. 100 ul av kontrastfargeløsningen ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble målt umiddelbart ved 450 nm. Resultatene er uttrykt i pikogram per milliliter.

Statistisk analyse. Statistisk analyse ble utført ved bruk av Statistica-programmet (StatSoft 13.3). Shapiro-Wilk normalitetstesten av de undersøkte variablene og de presenterte frekvensdiagrammene viste at fordelingen av variablene ikke var normal. De ikke-parametriske Wald-Wolfowitz- og U Mann-Whitney-testene ble brukt til å sammenligne studiegruppen med kontrollgruppen. Signifikanstesten av korrelasjonskoeffisienten var basert på statistikken for Studentens t-fordeling.