Entzündungsfördernde Zytokine und Implantationsprozess bei Frauen mit primärer idiopathischer Unfruchtbarkeit

Unfruchtbarkeit betrifft etwa 8 bis 12 % der Paare im gebärfähigen Alter weltweit, was mehr als 186 Millionen Menschen entspricht.

Bei etwa 20 % der Paare kann der Erreger der Unfruchtbarkeit nach Routinediagnostik nicht identifiziert werden. Eine der Ursachen der idiopathischen Unfruchtbarkeit können Störungen des Einnistungsprozesses sein.

Die Implantation kann zu einem bestimmten Zeitpunkt im Menstruationszyklus erfolgen, wenn sich die Implantationskapazität der Blastozyste mit der Bereitschaft zur Aufnahme durch das Endometrium, der sogenannten endometrialen Rezeptivität, überschneidet.

Das Zeitintervall, in dem das Endometrium diese Eigenschaft aufweist, wird Implantationsfenster genannt.

Das Implantationsfenster beim Menschen ist ein Zeitraum von 3 bis 6 Tagen, es fällt auf die Hälfte der sekretorischen Phase – also 6 bis 10 Tage nach dem LH-Peak.

Der Erwerb der Empfänglichkeit durch das Endometrium spiegelt sich in zellulären und strukturellen Veränderungen wider.

Die Prozesse werden hormonell durch Östrogene und Progesteron ovariellen Ursprungs gesteuert. Darüber hinaus sind lokal produzierte Signalmoleküle wie Zytokine, Wachstumsfaktoren und Lipidmediatoren über autokrine, parakrine und juxtakrine Signalübertragung wichtig.

Genetisch empfänglich und entscheidend werden von den Hoxa10- und Hoxa11-Homöobox-Genen angetrieben, deren Expression durch die Wirkung von Steroidhormonen erhöht wird. Veränderungen auf zellulärer und molekularer Ebene innerhalb des Endometriums werden mit Prozessen wie Wundheilung und Abbau der Matrix während des Prozesses der Krebsinvasion verglichen.

Unter den Zellen des Immunsystems, die das Endometrium infiltrieren, dominieren mononukleäre Zellen: Makrophagen, Lymphozyten und NK-Zellen.

Bei der Betrachtung der Rolle lokaler Entzündungen für die Fertilität ist es wichtig, zwischen akuten und chronischen Entzündungen mittlerer oder geringer Intensität zu unterscheiden.

In der akuten Phase der Entzündungsreaktion wandern Zellen des Immunsystems in einer sorgfältig geplanten Abfolge von Ereignissen, die durch lösliche Mediatoren wie Zytokine, Chemokine und Akute-Phase-Proteine ​​erleichtert werden, zum Ort der Verletzung. Je nach Schwere der Verletzung kann diese Akutphase ausreichen, um den Schaden zu reparieren und Heilungsprozesse einzuleiten.

Eine anhaltende Entzündung als Folge einer längeren Stimulation oder einer unangemessenen Reaktion auf das eigene Gewebe kann zu einer chronischen Phase führen, in der Gewebeschäden und Fibrose auftreten können.

Das Profil der Moleküle, die bei einer bestimmten Entzündung zu sehen sind, hängt von der Schwere, Dauer und den Mechanismen ab, die am Entzündungsprozess beteiligt sind, sowie von der Fähigkeit des körpereigenen Immunsystems, darauf zu reagieren und sich anzupassen.

Ziel der Studie war es zu untersuchen, ob sich die Spiegel ausgewählter Entzündungsmoleküle – Interleukin18 und Histamin – in der Population von Frauen mit unbestimmter Unfruchtbarkeit im Vergleich zu Frauen mit natürlich gezeugten Nachkommen unterscheiden.

Materialien und Methoden Es wurde eine prospektive Querschnittsstudie durchgeführt. Das Studiendesign erhielt eine positive Stellungnahme des Bioethikausschusses der Jagiellonen-Universität Nr. 1072.6120.78.2017 vom 29. Juni 2017. Die Mittel wurden aus dem Zuschuss Nr. K / DSC / 00421 des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung erhalten. Die Studiengruppe bestand aus 58 Frauen, bei denen primäre Unfruchtbarkeit diagnostiziert wurde, und eine Kontrollgruppe bestand aus 8 Patientinnen mit natürlich gezeugten Nachkommen. Die Patientinnen wurden aus Frauen rekrutiert, die in der Klinik für Gynäkologische Endokrinologie und Gynäkologie stationär behandelt, in der Klinik für Gynäkologische Endokrinologie konsultiert und im Rahmen des umfassenden reproduktiven Gesundheitsprogramms im Zeitraum von November 2017 bis März 2020 diagnostiziert wurden.

Die Einschlusskriterien für die Studiengruppe wurden von Frauen im gebärfähigen Alter (18-40 Jahre alt) erfüllt, die an primärer Unfruchtbarkeit litten (mehr als ein Jahr lang erfolglos versuchten, schwanger zu werden), regelmäßig menstruierten und keine Hormontherapie erhielten.

Ausschlusskriterien waren: nachgewiesener männlicher Faktor der Unfruchtbarkeit, Tubenfaktor, Endometriose, Entzündungen im Beckenbereich – aktuell und in der Vorgeschichte, hormonelle Hintergründe der Unfruchtbarkeit, Adipositas, Insulinresistenz, Status nach mindestens einer Fehlgeburt und chronische Autoimmunerkrankungen.

Die Einschlusskriterien für die Kontrollgruppe erfüllten Patientinnen im gebärfähigen Alter (18–40 Jahre) mit natürlich gezeugten Nachkommen bis zum Alter von drei Jahren mit regelmäßiger Menstruation. Ausschlusskriterien waren: Zustand nach Operation an der Gebärmutter, einschließlich Kürettage der Gebärmutterhöhle, Endometriose, Beckenentzündung - vorhanden und in der Anamnese, mindestens eine Fehlgeburt, Adipositas, Insulinresistenz, chronische Autoimmunerkrankungen, Stillen.

Die für die Studie rekrutierten Patienten aus beiden Gruppen wurden während des Implantationsfensters untersucht. Der geeignete Zeitpunkt des Zyklus wurde durch Ultraschall-Ovulationsüberwachung bestimmt. Die Patienten berichteten um den 10. Tag des Zyklus herum, um das Wachstum des dominanten Follikels zu beobachten. Die Untersuchung wurde nach 3-4 Tagen wiederholt. Wenn das dominante Follikelwachstum bestätigt wurde, führte die Patientin 16 Tage vor dem erwarteten Einsetzen der Menstruation zu Hause einen Urin-LH-Test durch. Patientinnen berichteten 6-8 Tage nach dem LH-Peak oder, im Falle eines fragwürdigen Testergebnisses, in der Mitte der Lutealphase, bestimmt durch die berichtete Länge der Menstruationszyklen - 8-4 Tage vor dem Tag der erwarteten Periode. Bei der Visite erfolgte eine Ultraschalluntersuchung zur Bestätigung des abgelaufenen Eisprungs (Beobachtung des Gelbkörpers in einem identischen Eierstock, Endometrium mindestens 10 mm breit).

Die Patientinnen wurden über die Notwendigkeit des Geschlechtsverzichts in dem Zyklus, in dem die Studie durchgeführt wurde, aufgeklärt, was in der Studiendokumentation bestätigt wurde. Patienten, die diese Anforderung nicht akzeptierten, konnten nicht zur Studie zugelassen werden. Während des Besuchs wurde nach Bestätigung des Eisprungs eine Aspirationsbiopsie des Endometriums mit einer Plastikpipette mit einem Durchmesser von ca. 3 mm (Pipelle Endometrium-Saugkürette). Wenn es schwierig war, den Gebärmutterhalskanal mit einer Pipette zu durchdringen, wurde die Oberlippe des Gebärmutterhalses mit einer Klemme gefasst. Bei starken Schmerzen der Patientin oder der Unfähigkeit, den Zervikalkanal zu durchdringen, wurde die Materialentnahme abgebrochen. Unmittelbar nach der Untersuchung wurden die Patienten gebeten, die Schmerzintensität während des Eingriffs numerisch auf der numerischen Bewertungsskala (NRS) zu bewerten, wobei 0 überhaupt kein Schmerz und 10 der schlimmste vorstellbare Schmerz ist. Bei keinem der Patienten traten Komplikationen auf. Die entnommene Endometriumprobe wurde in einer Lösung aus 10 % neutralem, gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur aufbewahrt und dann zur Fixierung in Paraffinblöcken an die Abteilung für klinische und experimentelle Pathologie des CMUJ überführt.

Am selben Tag wurde von jedem Patienten eine 5-ml-Venenblutprobe auf EDTA entnommen. Das Blut wurde 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, und das Serum wurde zur Bestimmung der IL-18- und Histaminspiegel an die Abteilung für klinische Biochemie des medizinischen Colleges der Jagiellonen-Universität geschickt.

Immunhistochemie Gewebematerial wurde für 24 Stunden in Formaldehyd fixiert. Dann wurde es in 70%iger Ethanollösung dehydriert und dann in Paraffin eingebettet. Die Gewebe wurden 4 um dick geschnitten und auf silanisierten Objektträgern befestigt. Die Abschnitte wurden in drei gleiche Sätze aufgeteilt. Paraffinzubereitungen wurden entparaffiniert (3 Xylolaustausche bei Raumtemperatur; der erste Austausch – 10 Minuten, der zweite und dritte Austausch nach 15 Minuten) und rehydriert (3 Alkoholaustausche bei Raumtemperatur, jeweils 5 Minuten). Anschließend wurden die Präparate 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. in einer 3%igen H2O2-Lösung, um endogene Peroxidase zu blockieren. Objektträger wurden in destilliertem Wasser gespült und mit TBS für 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger mit Citratpuffer pH 6,0 im Wasserbad bei 97°C demaskiert. Nachdem die Präparate demaskiert waren, wurde das Ultra Vision Protein Block-Präparat (Thermo Scientific) für 5 min aufgetragen. bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer. Dann wurde der entsprechende Antikörper aufgetragen und bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für eine bestimmte Zeit inkubiert (Tabelle 1). Der erste Schnittsatz wurde mit IL-18-reaktiven polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (rekombinantes IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Kat.-Nr. Nr. PAA064HU01) bei einer Verdünnung von 1:00 für 60 min. Der zweite Satz wurde mit Histamin-reaktiven polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (Rekombinantes menschliches Histamin (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, Katalog-Nr. PAA927Ge01) bei einer Verdünnung von 1:100 für 30 min. Der dritte Satz wurde mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (rekombinantes menschliches GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., Katalog-Nr. PAC023HU01) bei einer Verdünnung von 1:50 für 30 min. Überschüssiger Antikörper wurde mit TBS-Puffer gewaschen und eine Post-Antikörperblockierung für Bright Vision plus (BrightVision + Ziegen-Anti-Maus/Kaninchen-HRP – ImmunoLogic-Kit) wurde angewendet. Wir inkubieren 20 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur.

Überschüssiges Reagenz wurde mit TBS-Puffer abgewaschen und eine Poly-HRP-GAMs/Rb-IgG-Präparation (BrightVision + Ziegen-anti-Maus/Kaninchen-HRP – ImmunoLogic-Kit) wurde aufgetragen. Inkubiert bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für 30 Minuten. Überschüssiges Reagenz wurde mit TBS-Puffer abgewaschen und DAB Quanto (Thermo Scientific) wurde aufgetragen. Inkubiert bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer für etwa 5 Minuten. Dann wurde das überschüssige Reagenz mit destilliertem Wasser gespült und die Objektträger wurden mit Hämatoxylin (Thermo Scientific) gefärbt. Die Präparate wurden entwässert, indem eine Reihe von drei Wechseln von Alkohol und Xylol in steigenden Konzentrationen durchgeführt wurden. Verschlossen mit einem Deckglas (CYTOSEAL von ThermoScientific). Die Expression jedes Zytokins wurde halbquantitativ als Anzahl positiver Zellen pro Quadratmillimeter in der analysierten Probe bewertet, berechnet unter Verwendung eines Bildanalysators.

IL-18 und Histamin im Blut Serum-IL-18-Messung wurde durch ELISA unter Verwendung von humanem rekombinantem IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, Katalog-Nr. Orb50153). Blutproben und Reagenzien wurden auf 37 °C erwärmt und dann 1:2 mit dem Verdünnungsmittel unter Verwendung von 50 &mgr;l Puffer unter vollständigem und gleichmäßigem Mischen verdünnt. Die Lösung wurde mit 0,1 ml pro Vertiefung verteilt. Die Mikroliterplatte mit den Wells wurde mit einem Deckel abgedeckt und 90 min bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde dann getrocknet, 0,1 ml biotinylierte Anti-Human-IL-18-Antikörperlösung wurde zu jeder Vertiefung gegeben und bei 37°C für 60 min inkubiert. Die Platte wurde dann dreimal in 0,01 M TBS (TRIS-gepufferte Kochsalzlösung) gewaschen, wobei der Waschpuffer jedes Mal für 1 Minute in der Vertiefung belassen wurde. Der Puffer wurde entfernt und die Platte wurde getrocknet, dann wurden 0,1 ml der hergestellten Avidin-Biotin-Peroxidase (ABC)-Lösung zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte wurde bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Platte wurde erneut gespült, dieses Mal 5 Mal mit 0,01 M TBS, und der Waschpuffer wurde jedes Mal für 1–2 min in den Vertiefungen belassen. Der Puffer wurde entfernt und die Platte wurde getrocknet, dann wurden 90 &mgr;l TMB-Farbstoff zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte wurde bei 37°C für 10 min inkubiert. 0,1 ml TMB-Kontrastfarbstofflösung wurde zu jeder Vertiefung gegeben und die Extinktion wurde sofort bei 450 nm gemessen. Die Histaminspiegel im Serum wurden durch ELISA unter Verwendung des Histamin ELISA Immundiagnostik-Reagens, Katalognummer K 8212, gemessen. Das Waschpufferkonzentrat (WASHBUF B) wurde 1:10 in reinem Wasser verdünnt. Die Reagenzien wurden auf Raumtemperatur gebracht. Die Plasmaproben wurden mit dem Derivatisierungsreagenz gemischt. Die derivatisierte Probe wurde dann auf einem horizontalen Schüttler zusammen mit einem Peroxidase-markierten polyklonalen Histamin-Antikörper auf einer Histamin-Derivat-beschichteten ELISA-Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde der Inhalt der Vertiefungen fünfmal mit 250 &mgr;l des Waschpuffers gewaschen. Nach dem letzten Schritt wurde restlicher Puffer mit Seidenpapier entfernt. Dann wurden 100 μl Substrat (SUB) in jede Vertiefung pipettiert, für 15 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert. 100 ul der Kontrastfarbstofflösung wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Extinktion wurde sofort bei 450 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Pikogramm pro Milliliter ausgedrückt.

Statistische Analyse. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Statistica-Programms (StatSoft 13.3) durchgeführt. Der Shapiro-Wilk-Normalitätstest der untersuchten Variablen und die präsentierten Häufigkeitsdiagramme zeigten, dass die Verteilung der Variablen nicht normal war. Die nichtparametrischen Wald-Wolfowitz- und U Mann-Whitney-Tests wurden verwendet, um die Studiengruppe mit der Kontrollgruppe zu vergleichen. Der Signifikanztest des Korrelationskoeffizienten basierte auf der Statistik für die Student's t-Verteilung.