Proinflammatoriska cytokiner och implantationsprocess hos kvinnor med primär idiopatisk infertilitet

Infertilitet drabbar cirka 8 till 12 % av par i reproduktiv ålder världen över, vilket motsvarar mer än 186 miljoner människor.

Hos cirka 20 % av paren kan orsaken till infertilitet inte identifieras efter rutinmässiga diagnostiska tester. En av orsakerna till idiopatisk infertilitet kan vara störningar i implantationsprocessen.

Implantation kan ske vid en specifik punkt i menstruationscykeln, när blastocystens förmåga att implantera överlappas med beredskap för dess acceptans av endometriet, den så kallade endometriemottagligheten.

Tidsintervallet under vilket endometriet uppvisar denna egenskap kallas implantationsfönstret.

Implantationsfönstret hos människor är en period på 3 till 6 dagar, det faller på hälften av den sekretoriska fasen - det vill säga 6 till 10 dagar efter LH-toppen.

Förvärvet av mottaglighet av endometrium återspeglas i cellulära och strukturella förändringar.

Processerna styrs hormonellt av östrogener och progesteron av äggstocksursprung. Dessutom är lokalt producerade signalmolekyler som cytokiner, tillväxtfaktorer och lipidmediatorer via autokrin, parakrin och juxtakrin signalering viktiga.

Genetiskt mottagliga och avgörande drivs av Hoxa10- och Hoxa11-homeobox-generna, vars uttryck ökas av steroidhormonernas inverkan. Förändringar på cellulära och molekylära nivåer i endometrium jämförs med processer som sårläkning och nedbrytning av matrisen under processen med cancerinvasion.

Bland cellerna i immunsystemet som infiltrerar endometriet dominerar mononukleära celler: makrofager, lymfocyter och NK-celler.

När man överväger vilken roll lokal inflammation spelar i fertiliteten är det viktigt att skilja mellan akut och kronisk inflammation av måttlig eller låg intensitet.

I den akuta fasen av det inflammatoriska svaret migrerar celler i immunsystemet till skadestället i en noggrant planerad sekvens av händelser som underlättas av lösliga mediatorer såsom cytokiner, kemokiner och akutfasproteiner. Beroende på skadans svårighetsgrad kan denna akuta fas vara tillräcklig för att reparera skadan och initiera läkningsprocesser.

Långvarig inflammation, till följd av långvarig exponering för stimulering eller ett olämpligt svar mot den egna vävnaden, kan leda till en kronisk fas, där vävnadsskador och fibros kan uppstå.

Profilen för molekylerna som ses i en given inflammation beror på svårighetsgraden, varaktigheten och mekanismerna som är involverade i inflammationsprocessen, samt förmågan hos kroppens immunsystem att reagera och anpassa sig.

Syftet med studien var att undersöka om nivåerna av utvalda inflammatoriska molekyler - interleukin18 och histamin, skiljer sig i populationen av kvinnor med obestämd infertilitet jämfört med kvinnor med naturligt befruktade avkommor.

Material och metoder En prospektiv tvärsnittsstudie genomfördes. Studiedesignen fick ett positivt yttrande från Bioethics Committee vid Jagiellonian University nr 1072.6120.78.2017 daterad 29 juni 2017. Medlen erhölls från anslag nr K / DSC / 00421 från ministeriet för vetenskap och högre utbildning. Studiegruppen bestod av 58 kvinnor med diagnosen primär infertilitet, och en kontrollgrupp bestod av 8 patienter med naturligt avlade avkommor. Patienter rekryterades bland kvinnor som var inlagda på sjukhus vid Gynecological Endocrinology and Gynecology Clinic, konsulterade på Gynecological Endocrinology Clinic och diagnostiserades enligt Comprehensive Reproductive Health Program under perioden november 2017 till mars 2020.

Inklusionskriterierna för studiegruppen uppfylldes av kvinnor i reproduktiv ålder (18-40 år) som lider av primär infertilitet (försöker utan framgång bli gravid i mer än ett år), menstruerar regelbundet och inte använder hormonbehandling.

Uteslutningskriterierna var: etablerad manlig faktor för infertilitet, tubal faktor, endometrios, inflammation i bäckenområdet - för närvarande och i historien, hormonell bakgrund av infertilitet, fetma, insulinresistens, status efter minst ett missfall och kroniska autoimmuna sjukdomar.

Inklusionskriterierna för kontrollgruppen uppfylldes av patienter i reproduktiv ålder (18-40 år) med naturligt befruktade avkommor upp till tre års ålder, med regelbunden menstruation. Uteslutningskriterierna var: tillstånd efter operation av livmodern, inklusive curettage av livmoderhålan, endometrios, bäckeninflammation - närvarande och i historien, minst ett missfall, fetma, insulinresistens, kroniska autoimmuna sjukdomar, amning.

Patienter från båda grupperna som rekryterats till studien undersöktes under implantationsfönstret. Lämplig tidpunkt för cykeln bestämdes genom ultraljudsövervakning av ägglossning. Patienter rapporterade omkring dag 10 i cykeln för att observera tillväxten av den dominerande follikeln. Undersökningen upprepades efter 3-4 dagar. Om den dominerande follikeltillväxten bekräftades utförde patienten ett urin-LH-test hemma 16 dagar före förväntad menstruation. Patienter rapporterade 6-8 dagar efter LH-toppen eller, vid tveksamt testresultat, i mitten av lutealfasen bestämt av den rapporterade längden på menstruationscyklerna - 8-4 dagar före dagen för den förväntade menstruationen. Under besöket gjordes en ultraljudsundersökning för att bekräfta tidigare ägglossning (observation av gulkroppen i en identisk äggstock, endometrium minst 10 mm brett).

Patienterna informerades om nödvändigheten av att avstå från samlag i den cykel där studien genomfördes, vilket bekräftades i studiedokumentationen. Patienter som inte accepterade detta krav kunde inte tas in i studien. Under besöket, efter att ägglossningen bekräftats, utfördes endometrieaspirationsbiopsi med en plastpipett med en diameter på ca. 3 mm (Pipelle Endometrial Suction Curette). Om det fanns svårigheter att penetrera livmoderhalskanalen med en pipett, greps livmoderhalsens överläp med en klämma. Vid svår smärta hos patienten eller oförmåga att penetrera livmoderhalskanalen avbröts insamlingen av materialet. Omedelbart efter undersökningen ombads patienterna att bedöma smärtintensiteten under ingreppet numeriskt på den numeriska betygsskalan (NRS), där 0 är ingen smärta alls och 10 är den värsta smärtan man kan tänka sig. Det fanns inga komplikationer hos någon av patienterna. Det insamlade endometrieprovet bevarades i en lösning av 10 % neutralt, buffrat formalin vid rumstemperatur och överfördes sedan till CMUJ Clinical and Experimental Pathology Department för fixering i paraffinblock.

Samma dag togs ett 5 ml venöst blodprov på EDTA från varje patient. Blodet centrifugerades i 15 minuter vid 3000 rpm och serumet skickades till Institutionen för klinisk biokemi vid Jagiellonian University Medical College för bestämning av IL-18- och histaminnivåer.

Immunhistokemi Vävnadsmaterial fixerades i formaldehyd under 24 timmar. Sedan dehydratiserades den i 70% etanollösning och bäddades sedan in i paraffin. Vävnader sektionerades med en tjocklek av 4 µm och monterades på silaniserade objektglas. Sektionerna delades in i tre lika stora set. Paraffinberedningar avvaxades (3 xylenbyten vid rumstemperatur; det första utbytet - 10 minuter, det andra och tredje utbytet efter 15 minuter) och rehydratiserades (3 alkoholbyten vid rumstemperatur, 5 minuter vardera). Därefter inkuberades preparaten vid rumstemperatur under 10 min. i en 3% H2O2-lösning för att blockera endogent peroxidas. Objektglasen sköljdes i destillerat vatten och inkuberades med TBS under 5 minuter. Därefter avmaskerades objektglasen med citratbuffert pH 6,0 i ett vattenbad vid 97°C. Efter att preparaten demaskerats applicerades Ultra Vision Protein Block-preparatet (Thermo Scientific) i 5 min. vid rumstemperatur i en fuktig kammare. Därefter applicerades den lämpliga antikroppen och inkuberades vid rumstemperatur i en fuktig kammare under en specificerad tid (tabell 1). Den första uppsättningen sektioner inkuberades med IL-18 reaktiva polyklonala kaninantikroppar (Rekombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Kat. nr. PAA064HU01) vid en utspädning av 1:00 under 60 min. Den andra uppsättningen inkuberades med histaminreaktiva polyklonala kaninantikroppar (rekombinant humant histamin (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, katalognr. PAA927Ge01) vid en utspädning av 1:100 under 30 min. Den tredje uppsättningen inkuberades med polyklonala kaninantikroppar (Rekombinant humant GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., katalognr. PAC023HU01) vid en utspädning av 1:50 under 30 min. Överskott av antikropp tvättades med TBS-buffert och Post-antikroppsblockering för Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-mus/kanin HRP - ImmunoLogic kit) applicerades. Vi inkuberar i en fuktig kammare vid rumstemperatur i 20 minuter.

Överskott av reagens tvättades bort med TBS-buffert och ett poly-HRP-GAMs/Rb IgG-preparat (BrightVision + Goat anti-mus/kanin HRP - ImmunoLogic kit) applicerades. Inkuberad vid rumstemperatur i en fuktig kammare i 30 minuter. Överskott av reagens tvättades bort med TBS-buffert och DAB Quanto (Thermo Scientific) applicerades. Inkuberad vid rumstemperatur i en fuktig kammare i ca 5 minuter. Därefter sköljdes överskottet av reagens med destillerat vatten och objektglasen färgades med hematoxylin (Thermo Scientific). Preparaten dehydrerades genom att utföra en serie med tre byten av alkohol och xylen i ökande koncentrationer. Stängs med ett täckglas (CYTOSEAL av ThermoScientific). Uttryck av varje cytokin bedömdes semikvantitativt som antalet positiva celler per kvadratmillimeter i det analyserade provet, beräknat med hjälp av en bildanalysator.

IL-18 och histamin i blodet Serum IL-18-mätning utfördes med ELISA med användning av humant rekombinant IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, katalognr. Orb50153). Blodprover och reagens värmdes till 37°C och späddes sedan 1:2 med spädningsmedlet med användning av 50 µL buffert med fullständig och enhetlig blandning. Lösningen dispenserades 0,1 ml per brunn. Mikroliterplattan med brunnarna täcktes med ett lock och inkuberades vid 37°C under 90 min. Plattan torkades sedan, 0,1 ml biotinylerad anti-human IL-18-antikroppslösning sattes till varje brunn och inkuberades vid 37°C under 60 min. Plattan tvättades sedan tre gånger i 0,01 M TBS (TRIS-buffrad saltlösning), varje gång tvättbufferten lämnades i brunnen under 1 min. Bufferten avlägsnades och plattan torkades, sedan sattes 0,1 ml beredd avidin-biotin-peroxidas (ABC)-lösning till varje brunn och plattan inkuberades vid 37°C under 30 minuter. Plattan sköljdes igen, denna gång 5 gånger med 0,01 M TBS, och tvättbufferten lämnades i brunnarna i 1-2 minuter varje gång. Bufferten avlägsnades och plattan torkades, sedan sattes 90 pl TMB-färgämne till varje brunn och plattan inkuberades vid 37°C under 10 min. 0,1 ml TMB-kontrastfärglösning sattes till varje brunn och absorbansen mättes omedelbart vid 450 nm. Serumhistaminnivåer mättes med ELISA med Histamin ELISA Immundiagnostik-reagens, katalognummer K 8212. Tvättbuffertkoncentratet (WASHBUF B) späddes 1:10 i rent vatten. Reagens bringades till rumstemperatur. Plasmaproverna blandades med derivatiseringsreagenset. Det derivatiserade provet inkuberades sedan på en horisontell skakapparat tillsammans med en peroxidasmärkt polyklonal histaminantikropp på en histaminderivatbelagd ELISA-platta under 1 timme vid rumstemperatur. Därefter tvättades innehållet i brunnarna 5 gånger med 250 ul av tvättbufferten. Efter det sista steget avlägsnades kvarvarande buffert med silkespapper. Sedan pipetterades 100 μl substrat (SUB) i varje brunn, inkuberades i 15 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus. 100 ul av kontrastfärglösningen sattes till varje brunn. Absorbansen mättes omedelbart vid 450 nm. Resultaten uttrycks i pikogram per milliliter.

Statistisk analys. Statistisk analys utfördes med hjälp av programmet Statistica (StatSoft 13.3). Shapiro-Wilks normalitetsteste av de undersökta variablerna och de presenterade frekvensdiagrammen visade att fördelningen av variablerna inte var normal. De icke-parametriska Wald-Wolfowitz- och U Mann-Whitney-testerna användes för att jämföra studiegruppen med kontrollgruppen. Signifikanstestet av korrelationskoefficienten baserades på statistiken för Elevens t-fördelning.