Prozánětlivé cytokiny a proces implantace u žen s primární idiopatickou neplodností

Neplodnost celosvětově postihuje přibližně 8 až 12 % párů v reprodukčním věku, což odpovídá více než 186 milionům lidí.

Přibližně u 20 % párů nelze po rutinních diagnostických testech identifikovat původce neplodnosti. Jednou z příčin idiopatické neplodnosti mohou být poruchy procesu implantace.

Implantace může proběhnout v určitém bodě menstruačního cyklu, kdy se kapacita blastocysty implantovat překrývá s připraveností k jejímu přijetí endometriem, tzv. receptivitou endometria.

Časový interval, ve kterém endometrium vykazuje tuto vlastnost, se nazývá implantační okno.

Implantační okno u člověka je období 3 až 6 dnů, připadá na polovinu sekreční fáze - tedy 6 až 10 dnů po vrcholu LH.

Získání vnímavosti endometriem se odráží v buněčných a strukturálních změnách.

Procesy jsou hormonálně řízeny estrogeny a progesteronem ovariálního původu. Kromě toho jsou důležité lokálně produkované signální molekuly, jako jsou cytokiny, růstové faktory a lipidové mediátory prostřednictvím autokrinní, parakrinní a juxtakrinní signalizace.

Geneticky vnímavé a rozhodující jsou řízeny homeoboxovými geny Hoxa10 a Hoxa11, jejichž exprese je zvýšena působením steroidních hormonů. Změny na buněčné a molekulární úrovni v endometriu jsou srovnávány s procesy, jako je hojení ran a degradace matrix během procesu invaze rakoviny.

Mezi buňkami imunitního systému infiltrujícími endometrium dominují mononukleární buňky: makrofágy, lymfocyty a NK buňky.

Při zvažování role lokálního zánětu v plodnosti je nezbytné rozlišovat mezi akutním a chronickým zánětem střední nebo nízké intenzity.

V akutní fázi zánětlivé reakce migrují buňky imunitního systému do místa poranění v pečlivě naplánované sekvenci událostí, kterou usnadňují rozpustné mediátory, jako jsou cytokiny, chemokiny a proteiny akutní fáze. V závislosti na závažnosti poranění může tato akutní fáze stačit k nápravě poškození a zahájení hojivých procesů.

Dlouhodobý zánět v důsledku dlouhodobého působení stimulace nebo nepřiměřené reakce proti vlastním tkáním může vést k chronické fázi, ve které může dojít k poškození tkáně a fibróze.

Profil molekul pozorovaných u daného zánětu závisí na závažnosti, trvání a mechanismech zapojených do zánětlivého procesu, stejně jako na schopnosti imunitního systému těla reagovat a adaptovat se.

Cílem studie bylo zjistit, zda se hladiny vybraných zánětlivých molekul – interleukinu18 a histaminu, liší v populaci žen s neurčenou neplodností oproti ženám s přirozeně počatým potomkem.

Materiály a metody Byla provedena prospektivní průřezová studie. Návrh studie získal kladné stanovisko Bioetické komise Jagellonské univerzity č. 1072.6120.78.2017 ze dne 29. června 2017 Finanční prostředky byly získány z grantu č. K / DSC / 00421 Ministerstva vědy a vysokého školství. Studijní skupinu tvořilo 58 žen s diagnózou primární neplodnosti a kontrolní skupinu tvořilo 8 pacientek s přirozeně počatým potomkem. Pacientky byly rekrutovány z řad žen hospitalizovaných na Gynekologické endokrinologické a gynekologické klinice, konzultovaných na Gynekologické endokrinologické klinice a diagnostikovaných v rámci Komplexního programu reprodukčního zdraví v období od listopadu 2017 do března 2020.

Kritéria pro zařazení do sledovaného souboru splnily ženy v reprodukčním věku (18-40 let), trpící primární neplodností (neúspěšně se snaží otěhotnět déle než rok), pravidelně menstruující, neužívající hormonální terapii.

Vylučovací kritéria byla: prokázaný mužský faktor neplodnosti, tubární faktor, endometrióza, záněty v pánevní oblasti - v současnosti i v anamnéze, hormonální pozadí neplodnosti, obezita, inzulinová rezistence, stav po minimálně jednom potratu a chronická autoimunitní onemocnění.

Kritéria pro zařazení do kontrolní skupiny splňovaly pacientky v reprodukčním věku (18-40 let) s přirozeně počatým potomkem do tří let věku, s pravidelnou menstruací. Vylučovací kritéria byla: stav po operaci na děloze včetně kyretáže dutiny děložní, endometrióza, zánět pánve - přítomný i v anamnéze, alespoň jeden potrat, obezita, inzulinová rezistence, chronická autoimunitní onemocnění, kojení.

Pacienti z obou skupin přijatých do studie byli vyšetřeni během implantačního okna. Vhodné načasování cyklu bylo stanoveno ultrazvukovým monitorováním ovulace. Pacienti hlásili, že kolem 10. dne cyklu pozorovali růst dominantního folikulu. Vyšetření bylo opakováno po 3-4 dnech. Pokud se potvrdil dominantní růst folikulu, provedla pacientka doma 16 dní před očekávaným nástupem menstruace LH test v moči. Pacientky hlásily 6-8 dní po vrcholu LH nebo v případě pochybného výsledku testu uprostřed luteální fáze určené podle udávané délky menstruačních cyklů - 8-4 dny před dnem očekávané menstruace. Při vizitě bylo provedeno ultrazvukové vyšetření k potvrzení proběhlé ovulace (pozorování žlutého tělíska v identickém vaječníku, endometrium široké minimálně 10 mm).

Pacienti byli informováni o nutnosti vzdát se pohlavního styku v cyklu, ve kterém byla studie provedena, což bylo potvrzeno v dokumentaci studie. Pacienti, kteří tento požadavek neakceptovali, nemohli být do studie přijati. Při vizitě po potvrzení ovulace byla provedena aspirační biopsie endometria pomocí plastové pipety o průměru cca. 3 mm (Pipelle endometriální sací kyreta). Pokud byly potíže s pronikáním pipety do cervikálního kanálu, byl horní ret děložního čípku sevřen svorkou. V případě silné bolesti pacientky nebo neschopnosti proniknout do cervikálního kanálu byl odběr materiálu přerušen. Bezprostředně po vyšetření byli pacienti požádáni, aby ohodnotili intenzitu bolesti během výkonu numericky na numerické hodnotící škále (NRS), kde 0 je žádná bolest a 10 je nejhorší představitelná bolest. U žádného z pacientů nebyly žádné komplikace. Odebraný vzorek endometria byl konzervován v roztoku 10% neutrálního pufrovaného formalínu při pokojové teplotě a poté přenesen na Oddělení klinické a experimentální patologie ČMUJ k fixaci v parafínových blocích.

Ve stejný den byl od každého pacienta odebrán 5ml vzorek žilní krve na EDTA. Krev byla odstřeďována po dobu 15 minut při 3000 otáčkách za minutu a sérum bylo odesláno na Oddělení klinické biochemie Lékařské fakulty Jagellonské univerzity pro stanovení hladin IL-18 a histaminu.

Imunohistochemie Tkáňový materiál byl fixován ve formaldehydu po dobu 24 hodin. Poté byl dehydratován v 70% roztoku ethanolu a poté zalit do parafínu. Tkáně byly nařezány na 4 um tlusté a upevněny na silanizovaná sklíčka. Sekce byly rozděleny do tří stejných sad. Parafinové přípravky byly zbaveny vosku (3 xylenové výměny při teplotě místnosti; první výměna - 10 minut, druhá a třetí výměna po 15 minutách) a rehydratovány (3 výměny alkoholu při teplotě místnosti, každá 5 minut). Poté byly přípravky inkubovány při teplotě místnosti po dobu 10 minut. ve 3% roztoku H2O2 k blokování endogenní peroxidázy. Sklíčka byla opláchnuta v destilované vodě a inkubována s TBS po dobu 5 minut. Poté byla sklíčka odmaskována citrátovým pufrem pH 6,0 ve vodní lázni při 97 °C. Po odmaskování preparátů byl na 5 min aplikován přípravek Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific). při pokojové teplotě ve vlhké komoře. Poté byla aplikována vhodná protilátka a inkubována při teplotě místnosti ve vlhké komoře po specifikovanou dobu (tabulka 1). První sada řezů byla inkubována s IL-18 reaktivními králičími polyklonálními protilátkami (Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. č. PAA064HU01) při ředění 1:00 po dobu 60 min. Druhá sada byla inkubována s histaminem reaktivními králičími polyklonálními protilátkami (Rekombinantní lidský histamin (Met1~Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, katalogové č. PAA927Ge01) při ředění 1:100 po dobu 30 minut. Třetí sada byla inkubována s králičími polyklonálními protilátkami (Recombinant human GLUT4 (Met1~Ile163) Cloud-Clone Corp., katalogové č. PAC023HU01) při ředění 1:50 po dobu 30 minut. Přebytečná protilátka byla promyta TBS pufrem a byla aplikována Post protilátková blokace pro Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-myší/králičí HRP - ImmunoLogic kit). Inkubujeme ve vlhké komoře při pokojové teplotě po dobu 20 minut.

Přebytek činidla byl smyt TBS pufrem a byl aplikován poly-HRP-GAMs/Rb IgG přípravek (BrightVision + Goat anti-myší / králičí HRP - ImmunoLogic kit). Inkubováno při pokojové teplotě ve vlhké komoře po dobu 30 minut. Přebytek činidla byl smyt TBS pufrem a byl aplikován DAB Quanto (Thermo Scientific). Inkubuje se při pokojové teplotě ve vlhké komoře po dobu asi 5 minut. Poté byl přebytek činidla opláchnut destilovanou vodou a sklíčka byla obarvena hematoxylinem (Thermo Scientific). Preparáty byly dehydratovány provedením série tří výměn alkoholu a xylenu ve zvyšujících se koncentracích. Uzavřeno krycím sklíčkem (CYTOSEAL od ThermoScientific). Exprese každého cytokinu byla hodnocena semikvantitativně jako počet pozitivních buněk na čtvereční milimetr v analyzovaném vzorku, vypočítaný pomocí analyzátoru obrazu.

IL-18 a histamin v krvi Měření IL-18 v séru bylo prováděno metodou ELISA za použití lidského rekombinantního IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, katalogové č. Orb50153). Vzorky krve a reagencie byly zahřáté na 37 °C a poté zředěny 1:2 ředidlem za použití 50 ul pufru s úplným a rovnoměrným promícháním. Roztok byl rozdělen 0,1 ml na jamku. Mikrolitrová destička s jamkami byla zakryta víčkem a inkubována při 37 °C po dobu 90 minut. Destička byla poté vysušena, do každé jamky bylo přidáno 0,1 ml roztoku biotinylované anti-lidské IL-18 protilátky a inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut. Destička byla poté třikrát promyta v 0,01 M TBS (TRIS pufrovaný fyziologický roztok), pokaždé ponechání promývacího pufru v jamce po dobu 1 minuty. Pufr byl odstraněn a destička byla vysušena, poté bylo do každé jamky přidáno 0,1 ml připraveného roztoku avidin-biotin-peroxidázy (ABC) a destička byla inkubována při 37 °C po dobu 30 minut. Destička byla znovu opláchnuta, tentokrát 5krát 0,01 M TBS, a promývací pufr byl ponechán v jamkách pokaždé 1-2 minuty. Pufr byl odstraněn a destička byla vysušena, poté bylo do každé jamky přidáno 90 ul TMB barviva a destička byla inkubována při 37 °C po dobu 10 minut. Do každé jamky se přidalo 0,1 ml roztoku kontrastního barviva TMB a okamžitě se změřila absorbance při 450 nm. Hladiny histaminu v séru byly měřeny metodou ELISA za použití činidla Histamin ELISA Immundiagnostik, katalogové číslo K 8212. Koncentrát promývacího pufru (WASHBUF B) byl zředěn 1:10 v čisté vodě. Reakční činidla byla přivedena na teplotu místnosti. Vzorky plazmy byly smíchány s derivatizačním činidlem. Derivatizovaný vzorek byl poté inkubován na horizontální třepačce spolu s peroxidázou značenou polyklonální histaminovou protilátkou na destičce ELISA potažené derivátem histaminu po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Poté byl obsah jamek 5krát promyt 250 ul promývacího pufru. Po posledním kroku byl zbytkový pufr odstraněn hedvábným papírem. Poté bylo do každé jamky napipetováno 100 ul substrátu (SUB), inkubováno po dobu 15 minut při teplotě místnosti, chráněno před světlem. Do každé jamky bylo přidáno 100 ul roztoku kontrastního barviva. Absorbance byla měřena okamžitě při 450 nm. Výsledky jsou vyjádřeny v pikogramech na mililitr.

Statistická analýza. Statistická analýza byla provedena pomocí programu Statistica (StatSoft 13.3). Shapiro-Wilkův test normality zkoumaných proměnných a prezentované frekvenční grafy ukázaly, že rozložení proměnných nebylo normální. Pro srovnání studijní skupiny s kontrolní skupinou byly použity neparametrické Wald-Wolfowitzovy a U Mann-Whitneyovy testy. Test významnosti korelačního koeficientu vycházel ze statistiky pro Studentovo t-rozdělení.