Citochine pro-infiammatorie e processo di impianto nelle donne con infertilità idiopatica primaria

L'infertilità colpisce circa l'8-12% delle coppie in età riproduttiva in tutto il mondo, pari a oltre 186 milioni di persone.

In circa il 20% delle coppie, l'agente eziologico dell'infertilità non può essere identificato dopo i test diagnostici di routine. Una delle cause dell'infertilità idiopatica possono essere i disturbi del processo di impianto.

L'impianto può avvenire in un punto specifico del ciclo mestruale, quando la capacità della blastocisti di impiantarsi si sovrappone alla disponibilità alla sua accettazione da parte dell'endometrio, la cosiddetta ricettività endometriale.

L'intervallo di tempo in cui l'endometrio mostra questa proprietà è chiamato finestra di impianto.

La finestra di impianto nell'uomo è un periodo da 3 a 6 giorni, cade su metà della fase secretoria, cioè da 6 a 10 giorni dopo il picco di LH.

L'acquisizione della ricettività da parte dell'endometrio si riflette nei cambiamenti cellulari e strutturali.

I processi sono controllati ormonalmente da estrogeni e progesterone di origine ovarica. Inoltre, le molecole di segnalazione prodotte localmente come citochine, fattori di crescita e mediatori lipidici tramite segnalazione autocrina, paracrina e juxtacrina sono importanti.

Geneticamente ricettivi e decisivi sono guidati dai geni homeobox Hoxa10 e Hoxa11, la cui espressione è aumentata dall'azione degli ormoni steroidei. I cambiamenti a livello cellulare e molecolare all'interno dell'endometrio vengono confrontati con processi come la guarigione delle ferite e il degrado della matrice durante il processo di invasione del cancro.

Tra le cellule del sistema immunitario che infiltrano l'endometrio, dominano le cellule mononucleate: macrofagi, linfociti e cellule NK.

Nel considerare il ruolo dell'infiammazione locale nella fertilità, è essenziale distinguere tra infiammazione acuta e cronica di moderata o bassa intensità.

Nella fase acuta della risposta infiammatoria, le cellule del sistema immunitario migrano verso il sito della lesione in una sequenza di eventi attentamente pianificata facilitata da mediatori solubili come citochine, chemochine e proteine ​​della fase acuta. A seconda della gravità della lesione, questa fase acuta può essere sufficiente per riparare il danno e avviare i processi di guarigione.

L'infiammazione prolungata, come risultato di una prolungata esposizione alla stimolazione o di una risposta inappropriata nei confronti dei propri tessuti, può portare a una fase cronica, in cui possono verificarsi danno tissutale e fibrosi.

Il profilo delle molecole osservate in una data infiammazione dipende dalla gravità, dalla durata e dai meccanismi coinvolti nel processo infiammatorio, nonché dalla capacità del sistema immunitario del corpo di rispondere e adattarsi.

Scopo dello studio era indagare se i livelli di molecole infiammatorie selezionate - interleuchina18 e istamina, differiscono nella popolazione di donne con infertilità indeterminata rispetto alle donne con prole concepita naturalmente.

Materiali e metodi È stato condotto uno studio prospettico trasversale. Il disegno dello studio ha ricevuto parere positivo del Comitato di Bioetica dell'Università Jagellonica n. 1072.6120.78.2017 del 29 giugno 2017 I fondi sono stati ottenuti dalla borsa di studio n. K/DSC/00421 del Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore. Il gruppo di studio era composto da 58 donne con diagnosi di infertilità primaria e un gruppo di controllo era composto da 8 pazienti con prole concepita naturalmente. I pazienti sono stati reclutati tra le donne ricoverate presso la Clinica Ginecologica di Endocrinologia e Ginecologia, consultate presso la Clinica di Endocrinologia Ginecologica e diagnosticate nell'ambito del Programma completo di salute riproduttiva nel periodo da novembre 2017 a marzo 2020.

I criteri di inclusione per il gruppo di studio sono stati soddisfatti da donne in età riproduttiva (18-40 anni) affette da infertilità primaria (tentativo senza successo di rimanere incinta per più di un anno), mestruazioni regolari, che non utilizzano la terapia ormonale.

I criteri di esclusione erano: fattore maschile stabilito di infertilità, fattore tubarico, endometriosi, infiammazione nell'area pelvica - attualmente e nella storia, background ormonale di infertilità, obesità, insulino-resistenza, stato dopo almeno un aborto spontaneo e malattie autoimmuni croniche.

I criteri di inclusione per il gruppo di controllo sono stati soddisfatti da pazienti in età riproduttiva (18-40 anni) con prole concepita naturalmente fino a tre anni di età, con mestruazioni regolari. I criteri di esclusione erano: condizione dopo l'intervento chirurgico sull'utero, incluso curettage della cavità uterina, endometriosi, infiammazione pelvica - presente e nella storia, almeno un aborto spontaneo, obesità, insulino-resistenza, malattie autoimmuni croniche, allattamento al seno.

I pazienti di entrambi i gruppi reclutati per lo studio sono stati esaminati durante la finestra dell'impianto. La tempistica appropriata del ciclo è stata determinata dal monitoraggio ecografico dell'ovulazione. I pazienti hanno riferito intorno al giorno 10 del ciclo di osservare la crescita del follicolo dominante. L'esame è stato ripetuto dopo 3-4 giorni. Se la crescita del follicolo dominante è stata confermata, la paziente ha eseguito un test dell'LH nelle urine a casa 16 giorni prima dell'inizio previsto delle mestruazioni. I pazienti hanno riportato 6-8 giorni dopo il picco di LH o, in caso di risultato discutibile del test, nel mezzo della fase luteale determinata dalla lunghezza riportata dei cicli mestruali - 8-4 giorni prima del giorno del ciclo previsto. Durante la visita è stato eseguito un esame ecografico per confermare la pregressa ovulazione (osservazione del corpo luteo in un ovaio identico, endometrio largo almeno 10 mm).

I pazienti sono stati informati della necessità di interrompere i rapporti nel ciclo in cui è stato condotto lo studio, il che è stato confermato nella documentazione dello studio. I pazienti che non hanno accettato questo requisito non hanno potuto essere ammessi allo studio. Durante la visita, dopo la conferma dell'ovulazione, è stata eseguita una biopsia di aspirazione endometriale utilizzando una pipetta di plastica del diametro di ca. 3 mm (Curette di aspirazione endometriale Pipelle). Se c'erano difficoltà a penetrare nel canale cervicale con una pipetta, il labbro superiore della cervice veniva afferrato con un morsetto. In caso di forte dolore nel paziente o impossibilità di penetrare nel canale cervicale, il prelievo del materiale è stato interrotto. Immediatamente dopo l'esame, ai pazienti è stato chiesto di valutare l'intensità del dolore durante la procedura numericamente sulla scala di valutazione numerica (NRS), dove 0 è nessun dolore e 10 è il peggior dolore immaginabile. Non ci sono state complicazioni in nessuno dei pazienti. Il campione endometriale raccolto è stato conservato in una soluzione di formalina tamponata neutra al 10% a temperatura ambiente e quindi trasferito al Dipartimento di Patologia Clinica e Sperimentale del CMUJ per la fissazione in blocchi di paraffina.

Lo stesso giorno, da ciascun paziente è stato prelevato un campione di sangue venoso di 5 ml su EDTA. Il sangue è stato centrifugato per 15 minuti a 3000 rpm e il siero è stato inviato al Dipartimento di Biochimica Clinica dell'Università di Medicina dell'Università Jagellonica per la determinazione dei livelli di IL-18 e di istamina.

Immunoistochimica Il materiale tissutale è stato fissato in formaldeide per 24 ore. Quindi è stato disidratato in una soluzione di etanolo al 70% e quindi incorporato in paraffina. I tessuti sono stati sezionati con uno spessore di 4 µm e montati su vetrini silanizzati. Le sezioni sono state divise in tre set uguali. Le preparazioni di paraffina sono state deparaffinate (3 scambi di xilene a temperatura ambiente; il primo scambio - 10 minuti, il secondo e il terzo scambio dopo 15 minuti) e reidratati (3 scambi di alcol a temperatura ambiente, 5 minuti ciascuno). Quindi le preparazioni sono state incubate a temperatura ambiente per 10 min. in una soluzione di H2O2 al 3% per bloccare la perossidasi endogena. I vetrini sono stati sciacquati in acqua distillata e incubati con TBS per 5 minuti. Quindi i vetrini sono stati smascherati con tampone citrato pH 6.0 in bagnomaria a 97°C. Dopo che le preparazioni sono state smascherate, è stata applicata la preparazione Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific) per 5 minuti. a temperatura ambiente in camera umida. Quindi l'anticorpo appropriato è stato applicato e incubato a temperatura ambiente in una camera umida per un tempo specificato (Tabella 1). Il primo set di sezioni è stato incubato con anticorpi policlonali di coniglio reattivi per IL-18 (Recombinant IL18 (Tyr37~Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. N. PAA064HU01) ad una diluizione di 1:00 per 60 min. Il secondo set è stato incubato con anticorpi policlonali di coniglio reattivi all'istamina (Recombinant human istamine (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0.35mg/ml, catalogo n. PAA927Ge01) alla diluizione 1:100 per 30 min. Il terzo set è stato incubato con anticorpi policlonali di coniglio (GLUT4 umano ricombinante (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., catalogo n. PAC023HU01) alla diluizione 1:50 per 30 min. L'anticorpo in eccesso è stato lavato con tampone TBS ed è stato applicato il blocco post anticorpo per Bright Vision plus (BrightVision + capra anti-topo/coniglio HRP - kit ImmunoLogic). Incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 20 minuti.

Il reagente in eccesso è stato lavato via con tampone TBS ed è stata applicata una preparazione poli-HRP-GAMs/Rb IgG (BrightVision + capra anti-topo/coniglio HRP - kit ImmunoLogic). Incubare a temperatura ambiente in una camera umida per 30 minuti. Il reagente in eccesso è stato lavato via con tampone TBS ed è stato applicato DAB Quanto (Thermo Scientific). Incubare a temperatura ambiente in una camera umida per circa 5 minuti. Quindi, il reagente in eccesso è stato risciacquato con acqua distillata e i vetrini sono stati colorati con ematossilina (Thermo Scientific). I preparati sono stati disidratati effettuando una serie di tre cambi di alcool e xilene in concentrazioni crescenti. Chiuso con coprioggetto (CYTOSEAL di ThermoScientific). L'espressione di ciascuna citochina è stata valutata semi-quantitativamente come il numero di cellule positive per millimetro quadrato nel campione analizzato, calcolato utilizzando un analizzatore di immagini.

IL-18 e istamina nel sangue La misurazione dell'IL-18 sierica è stata eseguita mediante ELISA utilizzando IL-18 ricombinante umano (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, catalogo n. Orb50153). Campioni di sangue e reagenti sono stati riscaldati a 37°C e quindi diluiti 1:2 con il diluente utilizzando 50 µL di tampone con miscelazione completa ed uniforme. La soluzione è stata dispensata 0,1 ml per pozzetto. La micropiastra con i pozzetti è stata coperta con un coperchio e incubata a 37°C per 90 min. La piastra è stata quindi essiccata, 0,1 ml di soluzione di anticorpi anti-IL-18 umana biotinilata sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a 37 ° C per 60 min. La piastra è stata quindi lavata tre volte in 0,01 M TBS (soluzione salina tamponata TRIS), lasciando ogni volta il tampone di lavaggio nel pozzetto per 1 minuto. Il tampone è stato rimosso e la piastra è stata asciugata, quindi sono stati aggiunti 0,1 ml di soluzione preparata di avidina-biotina-perossidasi (ABC) a ciascun pozzetto e la piastra è stata incubata a 37°C per 30 min. La piastra è stata nuovamente risciacquata, questa volta 5 volte con 0,01 M TBS, e il tampone di lavaggio è stato lasciato nei pozzetti per 1-2 minuti ogni volta. Il tampone è stato rimosso e la piastra è stata essiccata, quindi sono stati aggiunti 90 µl di colorante TMB a ciascun pozzetto e la piastra è stata incubata a 37°C per 10 min. 0,1 ml di soluzione di colorante di contrasto TMB sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e l'assorbanza è stata immediatamente misurata a 450 nm. I livelli sierici di istamina sono stati misurati mediante ELISA utilizzando il reagente Histamin ELISA Immundiagnostik, numero di catalogo K 8212. Il tampone di lavaggio concentrato (WASHBUF B) è stato diluito 1:10 in acqua pura. I reagenti sono stati portati a temperatura ambiente. I campioni di plasma sono stati miscelati con il reagente di derivatizzazione. Il campione derivatizzato è stato quindi incubato su un agitatore orizzontale insieme a un anticorpo policlonale istaminico marcato con perossidasi su una piastra ELISA rivestita con derivato istaminico per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi il contenuto dei pozzetti è stato lavato 5 volte con 250 pi del tampone di lavaggio. Dopo l'ultimo passaggio, il tampone residuo è stato rimosso con carta velina. Quindi 100 μl di substrato (SUB) sono stati pipettati in ciascun pozzetto, incubati per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. A ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 µl della soluzione di colorante di contrasto. L'assorbanza è stata misurata immediatamente a 450 nm. I risultati sono espressi in picogrammi per millilitro.

Analisi statistica. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il programma Statistica (StatSoft 13.3). Il test di normalità di Shapiro-Wilk delle variabili esaminate e i grafici di frequenza presentati hanno mostrato che la distribuzione delle variabili non era normale. I test non parametrici di Wald-Wolfowitz e U Mann-Whitney sono stati utilizzati per confrontare il gruppo di studio con il gruppo di controllo. Il test di significatività del coefficiente di correlazione era basato sulle statistiche per la distribuzione t di Student.