Citocinas pró-inflamatórias e processo de implantação em mulheres com infertilidade idiopática primária

A infertilidade afeta aproximadamente 8 a 12% dos casais em idade reprodutiva em todo o mundo, o equivalente a mais de 186 milhões de pessoas.

Em aproximadamente 20% dos casais, o agente causador da infertilidade não pode ser identificado após exames diagnósticos de rotina. Uma das causas da infertilidade idiopática pode ser distúrbios do processo de implantação.

A implantação pode ocorrer em um ponto específico do ciclo menstrual, quando a capacidade de implantação do blastocisto se sobrepõe à prontidão para sua aceitação pelo endométrio, a chamada receptividade endometrial.

O intervalo de tempo em que o endométrio exibe essa propriedade é chamado de janela de implantação.

A janela de implantação em humanos é um período de 3 a 6 dias, cai na metade da fase secretora - ou seja, 6 a 10 dias após o pico de LH.

A aquisição de receptividade pelo endométrio se reflete em mudanças celulares e estruturais.

Os processos são controlados hormonalmente por estrogênios e progesterona de origem ovariana. Além disso, moléculas de sinalização produzidas localmente, como citocinas, fatores de crescimento e mediadores lipídicos via sinalização autócrina, parácrina e justacrina, são importantes.

Geneticamente receptivos e decisivos são conduzidos pelos genes homeobox Hoxa10 e Hoxa11, cuja expressão é aumentada pela ação de hormônios esteróides. Alterações nos níveis celular e molecular dentro do endométrio são comparadas a processos como cicatrização de feridas e degradação da matriz durante o processo de invasão do câncer.

Entre as células do sistema imune que infiltram o endométrio, dominam as células mononucleares: macrófagos, linfócitos e células NK.

Ao considerar o papel da inflamação local na fertilidade, é essencial distinguir entre inflamação aguda e crônica de intensidade moderada ou baixa.

Na fase aguda da resposta inflamatória, as células do sistema imunológico migram para o local da lesão em uma sequência cuidadosamente planejada de eventos facilitados por mediadores solúveis como citocinas, quimiocinas e proteínas de fase aguda. Dependendo da gravidade da lesão, esta fase aguda pode ser suficiente para reparar o dano e iniciar os processos de cicatrização.

A inflamação prolongada, como resultado de uma exposição prolongada a estímulos ou de uma resposta inadequada contra os próprios tecidos, pode levar a uma fase crônica, na qual podem ocorrer dano tecidual e fibrose.

O perfil das moléculas observadas em uma determinada inflamação depende da gravidade, duração e mecanismos envolvidos no processo inflamatório, bem como da capacidade de resposta e adaptação do sistema imunológico do organismo.

O objetivo do estudo foi investigar se os níveis de moléculas inflamatórias selecionadas - interleucina18 e histamina, diferem na população de mulheres com infertilidade indeterminada em comparação com mulheres com filhos concebidos naturalmente.

Materiais e métodos Foi realizado um estudo prospectivo e transversal. O desenho do estudo recebeu um parecer positivo do Comitê de Bioética da Universidade Jagiellonian nº 1072.6120.78.2017 de 29 de junho de 2017. Os recursos foram obtidos da concessão nº K / DSC / 00421 do Ministério da Ciência e Ensino Superior. O grupo de estudo consistiu de 58 mulheres diagnosticadas com infertilidade primária, e um grupo de controle consistiu de 8 pacientes com filhos concebidos naturalmente. As pacientes foram recrutadas entre mulheres internadas no Ambulatório de Endocrinologia Ginecológica e Ginecológica, consultadas no Ambulatório de Endocrinologia Ginecológica e diagnosticadas no âmbito do Programa Integral de Saúde Reprodutiva no período de novembro de 2017 a março de 2020.

Os critérios de inclusão para o grupo de estudo foram mulheres em idade reprodutiva (18-40 anos) com infertilidade primária (tentando engravidar sem sucesso por mais de um ano), menstruando regularmente, sem uso de terapia hormonal.

Os critérios de exclusão foram: fator masculino estabelecido de infertilidade, fator tubário, endometriose, inflamação na região pélvica - atual e no passado, fundo hormonal de infertilidade, obesidade, resistência à insulina, estado pós pelo menos um aborto espontâneo e doenças autoimunes crônicas.

Os critérios de inclusão para o grupo controle foram atendidos por pacientes em idade reprodutiva (18-40 anos) com filhos concebidos naturalmente até três anos de idade, com menstruação regular. Os critérios de exclusão foram: condição após cirurgia no útero, incluindo curetagem da cavidade uterina, endometriose, inflamação pélvica - presente e na história, pelo menos um aborto espontâneo, obesidade, resistência à insulina, doenças autoimunes crônicas, amamentação.

Os pacientes de ambos os grupos recrutados para o estudo foram examinados durante a janela de implantação. O momento apropriado do ciclo foi determinado pelo monitoramento da ovulação por ultrassom. Os pacientes relataram em torno do dia 10 do ciclo para observar o crescimento do folículo dominante. O exame foi repetido após 3-4 dias. Se o crescimento do folículo dominante fosse confirmado, a paciente realizava teste de LH na urina em casa 16 dias antes do início esperado da menstruação. As pacientes relataram 6-8 dias após o pico de LH ou, em caso de teste questionável, no meio da fase lútea determinada pela duração relatada dos ciclos menstruais - 8-4 dias antes do dia do período esperado. Durante a visita, foi realizado um exame de ultrassom para confirmar a ovulação passada (observação do corpo lúteo em um ovário idêntico, endométrio com pelo menos 10 mm de largura).

As pacientes foram informadas sobre a necessidade de interromper as relações sexuais no ciclo em que o estudo foi realizado, o que foi confirmado na documentação do estudo. Os pacientes que não aceitassem esse requisito não poderiam ser admitidos no estudo. Durante a visita, após a confirmação da ovulação, foi realizada biópsia aspirativa do endométrio com pipeta plástica com diâmetro de aprox. 3 mm (Pipelle Endometrial Suction Curette). Se houvesse dificuldade em penetrar no canal cervical com uma pipeta, o lábio superior do colo do útero era preso com uma pinça. No caso de dor intensa do paciente ou incapacidade de penetração no canal cervical, a coleta do material era interrompida. Imediatamente após o exame, os pacientes foram solicitados a classificar a intensidade da dor durante o procedimento numericamente na escala de classificação numérica (NRS), onde 0 é nenhuma dor e 10 é a pior dor imaginável. Não houve complicações em nenhum dos pacientes. A amostra endometrial coletada foi preservada em solução de formol tamponado a 10% neutro em temperatura ambiente e, a seguir, encaminhada ao Departamento de Patologia Clínica e Experimental do CMUJ para fixação em blocos de parafina.

No mesmo dia, uma amostra de 5 ml de sangue venoso em EDTA foi coletada de cada paciente. O sangue foi centrifugado por 15 minutos a 3.000 rpm e o soro foi enviado ao Departamento de Bioquímica Clínica do Jagiellonian University Medical College para determinação dos níveis de IL-18 e histamina.

Imuno-histoquímica O material tecidual foi fixado em formaldeído por 24 horas. Em seguida, foi desidratado em solução de etanol 70% e posteriormente embebido em parafina. Os tecidos foram seccionados com 4 µm de espessura e montados em lâminas silanizadas. As seções foram divididas em três conjuntos iguais. As preparações parafínicas foram desparafinadas (3 trocas de xileno em temperatura ambiente; a primeira troca - 10 minutos, a segunda e a terceira troca após 15 minutos) e reidratadas (3 trocas de álcool em temperatura ambiente, 5 minutos cada). Em seguida, as preparações foram incubadas à temperatura ambiente por 10 min. em solução de H2O2 a 3% para bloquear a peroxidase endógena. As lâminas foram lavadas em água destilada e incubadas com TBS por 5 minutos. Em seguida, as lâminas foram desmascaradas com tampão citrato pH 6,0 em banho-maria a 97°C. Depois que as preparações foram desmascaradas, a preparação Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific) foi aplicada por 5 min. à temperatura ambiente em câmara úmida. Em seguida, o anticorpo apropriado foi aplicado e incubado à temperatura ambiente em câmara úmida por tempo especificado (Tabela 1). O primeiro conjunto de cortes foi incubado com anticorpos policlonais de coelho reativos à IL-18 (IL18 recombinante (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. No. PAA064HU01) na diluição de 1:00 por 60 min. O segundo conjunto foi incubado com anticorpos policlonais de coelho reativos à histamina (Recombinant human histamine (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35mg/ml, catálogo no. PAA927Ge01) na diluição de 1:100 por 30 min. O terceiro conjunto foi incubado com anticorpos policlonais de coelho (GLUT4 humano recombinante (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., nº de catálogo PAC023HU01) na diluição de 1:50 por 30 min. O excesso de anticorpo foi lavado com tampão TBS e foi aplicado o bloqueio de anticorpo Post para Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-mouse/coelho HRP - kit ImmunoLogic). Incubamos em câmara úmida em temperatura ambiente por 20 minutos.

O excesso de reagente foi lavado com tampão TBS e uma preparação poli-HRP-GAMs / Rb IgG (BrightVision + anti-rato de cabra / coelho HRP - kit ImmunoLogic) foi aplicada. Incubado à temperatura ambiente em câmara úmida por 30 minutos. O excesso de reagente foi lavado com tampão TBS e DAB Quanto (Thermo Scientific) foi aplicado. Incubado à temperatura ambiente em câmara úmida por cerca de 5 minutos. Em seguida, o excesso de reagente foi lavado com água destilada e as lâminas coloridas com hematoxilina (Thermo Scientific). As preparações foram desidratadas realizando uma série de três trocas de álcool e xileno em concentrações crescentes. Fechado com uma lamínula (CYTOSEAL da ThermoScientific). A expressão de cada citocina foi avaliada semi-quantitativamente como o número de células positivas por milímetro quadrado na amostra analisada, calculado usando um analisador de imagem.

IL-18 e histamina no sangue A medição de IL-18 sérica foi realizada por ELISA usando IL-18 recombinante humana (Kit ELISA de IL-18 Humana, Biorbyt, catálogo no. Orb50153). Amostras de sangue e reagentes foram aquecidos a 37°C e então diluídos 1:2 com o diluente usando 50 µL de tampão com mistura completa e uniforme. A solução foi dispensada 0,1 ml por poço. A placa de microlitro com os poços foi tampada e incubada a 37°C por 90 min. A placa foi então seca, 0,1 ml de solução de anticorpo biotinilado anti-IL-18 humana foi adicionado a cada poço e incubado a 37 ° C por 60 min. A placa foi então lavada três vezes em 0,01 M TBS (TRIS tampão salino), cada vez deixando o tampão de lavagem no poço por 1 min. O tampão foi removido e a placa foi seca, então 0,1 ml de solução preparada de avidina-biotina-peroxidase (ABC) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada a 37 ° C por 30 min. A placa foi lavada novamente, desta vez 5 vezes com TBS 0,01 M, e o tampão de lavagem foi deixado nos poços por 1-2 min de cada vez. O tampão foi removido e a placa foi seca, então 90 µl de corante TMB foram adicionados a cada poço e a placa foi incubada a 37 ° C por 10 min. 0,1 ml de solução de corante de contraste TMB foi adicionado a cada poço e a absorbância foi imediatamente medida a 450 nm. Os níveis séricos de histamina foram medidos por ELISA usando o reagente Histamin ELISA Immundiagnostik, número de catálogo K 8212. O concentrado do tampão de lavagem (WASHBUF B) foi diluído 1:10 em água pura. Os reagentes foram levados à temperatura ambiente. As amostras de plasma foram misturadas com o reagente de derivatização. A amostra derivatizada foi então incubada em um agitador horizontal junto com um anticorpo policlonal histamínico marcado com peroxidase em uma placa de ELISA revestida com derivado de histamina por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida, o conteúdo dos poços foi lavado 5 vezes com 250 µl do tampão de lavagem. Após a última etapa, o tampão residual foi removido com papel de seda. Em seguida, 100 μl de substrato (SUB) foram pipetados em cada poço, incubados por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. 100 µl da solução de corante de contraste foram adicionados a cada poço. A absorbância foi medida imediatamente a 450 nm. Os resultados são expressos em picogramas por mililitro.

Análise estatística. A análise estatística foi realizada por meio do programa Statistica (StatSoft 13.3). O teste de normalidade Shapiro-Wilk das variáveis ​​examinadas e os gráficos de frequência apresentados mostraram que a distribuição das variáveis ​​não era normal. Os testes não paramétricos Wald-Wolfowitz e U Mann-Whitney foram usados ​​para comparar o grupo de estudo com o grupo controle. O teste de significância do coeficiente de correlação baseou-se na estatística da distribuição t de Student.