Pro-inflammatoriske cytokiner og implantationsproces hos kvinder med primær idiopatisk infertilitet

Infertilitet påvirker cirka 8 til 12 % af par i reproduktive alder på verdensplan, svarende til mere end 186 millioner mennesker.

Hos cirka 20 % af parrene kan årsagen til infertilitet ikke identificeres efter rutinemæssige diagnostiske tests. En af årsagerne til idiopatisk infertilitet kan være forstyrrelser i implantationsprocessen.

Implantation kan finde sted på et bestemt tidspunkt i menstruationscyklussen, når blastocystens kapacitet til at implantere overlappes med beredskabet til dets accept af endometriet, den såkaldte endometrie-receptivitet.

Det tidsinterval, hvori endometriet udviser denne egenskab, kaldes implantationsvinduet.

Implantationsvinduet hos mennesker er en periode på 3 til 6 dage, det falder på halvdelen af ​​den sekretoriske fase - det vil sige 6 til 10 dage efter LH-toppen.

Erhvervelsen af ​​modtagelighed af endometrium afspejles i cellulære og strukturelle ændringer.

Processerne styres hormonelt af østrogener og progesteron af æggestokke. Derudover er lokalt producerede signalmolekyler som cytokiner, vækstfaktorer og lipidmediatorer via autokrin, parakrin og juxtacrin signalering vigtige.

Genetisk modtagelige og afgørende er drevet af Hoxa10 og Hoxa11 homeobox-generne, hvis ekspression øges af virkningen af ​​steroidhormoner. Ændringer på det cellulære og molekylære niveau i endometriet sammenlignes med processer som sårheling og nedbrydning af matrixen under processen med cancerinvasion.

Blandt cellerne i immunsystemet, der infiltrerer endometriet, dominerer mononukleære celler: makrofager, lymfocytter og NK-celler.

Når man overvejer den rolle, lokal betændelse spiller i fertiliteten, er det vigtigt at skelne mellem akut og kronisk betændelse af moderat eller lav intensitet.

I den akutte fase af den inflammatoriske reaktion migrerer celler i immunsystemet til skadestedet i en nøje planlagt sekvens af hændelser lettet af opløselige mediatorer såsom cytokiner, kemokiner og akut fase proteiner. Afhængig af sværhedsgraden af ​​skaden kan denne akutte fase være tilstrækkelig til at reparere skaden og igangsætte helingsprocesser.

Langvarig betændelse, som følge af længere tids udsættelse for stimulering eller en uhensigtsmæssig reaktion mod eget væv, kan føre til en kronisk fase, hvor vævsskade og fibrose kan opstå.

Profilen af ​​molekylerne, der ses i en given betændelse, afhænger af sværhedsgraden, varigheden og mekanismerne involveret i inflammationsprocessen, samt kroppens immunsystems evne til at reagere og tilpasse sig.

Formålet med undersøgelsen var at undersøge, om niveauerne af udvalgte inflammatoriske molekyler - interleukin18 og histamin, adskiller sig i populationen af ​​kvinder med ubestemt infertilitet sammenlignet med kvinder med naturligt undfanget afkom.

Materialer og metoder Der er gennemført en prospektiv tværsnitsundersøgelse. Undersøgelsesdesignet modtog en positiv udtalelse fra Bioethics Committee ved Jagiellonian University nr. 1072.6120.78.2017 dateret 29. juni 2017 Midlerne blev opnået fra bevillingen nr. K / DSC / 00421 fra Ministeriet for Videnskab og Højere Uddannelse. Undersøgelsesgruppen bestod af 58 kvinder diagnosticeret med primær infertilitet, og en kontrolgruppe bestod af 8 patienter med naturligt undfanget afkom. Patienter blev rekrutteret blandt kvinder indlagt på Gynækologisk Endokrinologisk og Gynækologisk Klinik, konsulteret på Gynækologisk Endokrinologisk Klinik og diagnosticeret under Comprehensive Reproductive Health Program i perioden fra november 2017 til marts 2020.

Inklusionskriterierne for undersøgelsesgruppen blev opfyldt af kvinder i den fødedygtige alder (18-40 år), der lider af primær infertilitet (forgæves forsøger at blive gravid i mere end et år), menstruerede regelmæssigt og ikke brugte hormonbehandling.

Eksklusionskriterierne var: etableret mandlig infertilitetsfaktor, tubal faktor, endometriose, betændelse i bækkenområdet - i øjeblikket og i historien, hormonel baggrund for infertilitet, fedme, insulinresistens, status efter mindst én abort og kroniske autoimmune sygdomme.

Inklusionskriterierne for kontrolgruppen blev opfyldt af patienter i den reproduktive alder (18-40 år) med naturligt undfanget afkom op til tre år med regelmæssig menstruation. Eksklusionskriterierne var: tilstand efter operation af livmoderen, inklusive curettage af livmoderhulen, endometriose, bækkenbetændelse - til stede og i historien, mindst én spontan abort, fedme, insulinresistens, kroniske autoimmune sygdomme, amning.

Patienter fra begge grupper rekrutteret til undersøgelsen blev undersøgt under implantationsvinduet. Den passende timing af cyklussen blev bestemt ved ultralydsovervågning af ægløsning. Patienter rapporterede omkring dag 10 i cyklussen for at observere væksten af ​​den dominerende follikel. Undersøgelsen blev gentaget efter 3-4 dage. Hvis den dominerende follikelvækst blev bekræftet, udførte patienten en urin-LH-test hjemme 16 dage før den forventede menstruationsstart. Patienter rapporterede 6-8 dage efter LH-toppen eller, i tilfælde af tvivlsomt testresultat, midt i lutealfasen bestemt af den rapporterede længde af menstruationscyklusserne - 8-4 dage før dagen for den forventede menstruation. Under besøget blev der foretaget en ultralydsundersøgelse for at bekræfte tidligere ægløsning (observation af corpus luteum i en identisk æggestok, endometrium mindst 10 mm bredt).

Patienterne blev informeret om nødvendigheden af ​​at opgive samleje i den cyklus, hvori undersøgelsen blev gennemført, hvilket blev bekræftet i undersøgelsesdokumentationen. Patienter, der ikke accepterede dette krav, kunne ikke optages i undersøgelsen. Under besøget, efter at ægløsningen var bekræftet, blev der udført endometrieaspirationsbiopsi med en plastpipette med en diameter på ca. 3 mm (Pipelle Endometrial Suge Curette). Hvis der var vanskeligheder med at trænge ind i livmoderhalskanalen med en pipette, blev livmoderhalsens overlæbe grebet med en klemme. I tilfælde af stærke smerter hos patienten eller manglende evne til at trænge ind i livmoderhalskanalen, blev opsamlingen af ​​materialet afbrudt. Umiddelbart efter undersøgelsen blev patienterne bedt om at vurdere intensiteten af ​​smerte under proceduren numerisk på den numeriske vurderingsskala (NRS), hvor 0 er ingen smerte overhovedet og 10 er den værst tænkelige smerte. Der var ingen komplikationer hos nogen af ​​patienterne. Den indsamlede endometrieprøve blev konserveret i en opløsning af 10 % neutral, bufret formalin ved stuetemperatur og derefter overført til CMUJ Klinisk og Eksperimentel Patologiafdeling til fiksering i paraffinblokke.

Samme dag blev en 5 ml venøs blodprøve på EDTA indsamlet fra hver patient. Blodet blev centrifugeret i 15 minutter ved 3000 rpm, og serumet blev sendt til afdelingen for klinisk biokemi på Jagiellonian University Medical College til bestemmelse af IL-18- og histaminniveauer.

Immunhistokemi Vævsmateriale blev fikseret i formaldehyd i 24 timer. Derefter blev det dehydreret i 70% ethanolopløsning og derefter indlejret i paraffin. Væv blev snittet 4 µm tykt og monteret på silaniserede objektglas. Sektionerne blev opdelt i tre lige store sæt. Paraffinpræparater blev afvokset (3 xylenudskiftninger ved stuetemperatur; den første udskiftning - 10 minutter, den anden og tredje udskiftning efter 15 minutter) og rehydreret (3 alkoholudskiftninger ved stuetemperatur, 5 minutter hver). Derefter blev præparaterne inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. i en 3% H2O2-opløsning for at blokere endogen peroxidase. Objektglassene blev skyllet i destilleret vand og inkuberet med TBS i 5 minutter. Derefter blev objektglassene afmaskeret med citratbuffer pH 6,0 i et vandbad ved 97°C. Efter at præparaterne var afmasket, blev Ultra Vision Protein Block-præparatet (Thermo Scientific) påført i 5 min. ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Derefter blev det passende antistof påført og inkuberet ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i et specificeret tidsrum (tabel 1). Det første sæt snit blev inkuberet med IL-18-reaktive polyklonale kaninantistoffer (Rekombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml kat. nr. PAA064HU01) ved en fortynding på 1:00 i 60 min. Det andet sæt blev inkuberet med histaminreaktive polyklonale kaninantistoffer (rekombinant human histamin (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, katalognr. PAA927Ge01) ved en fortynding på 1:100 i 30 min. Det tredje sæt blev inkuberet med polyklonale kaninantistoffer (Rekombinant humant GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., katalognr. PAC023HU01) ved en fortynding på 1:50 i 30 min. Overskydende antistof blev vasket med TBS-buffer, og Post-antistofblokering for Bright Vision plus (BrightVision + Goat anti-mus/kanin HRP - ImmunoLogic kit) blev påført. Vi inkuberer i et fugtigt kammer ved stuetemperatur i 20 minutter.

Overskydende reagens blev vasket af med TBS-buffer, og et poly-HRP-GAMs/Rb IgG-præparat (BrightVision + Goat anti-mus/kanin HRP - ImmunoLogic kit) blev påført. Inkuberet ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i 30 minutter. Overskydende reagens blev vasket af med TBS-buffer, og DAB Quanto (Thermo Scientific) blev påført. Inkuberet ved stuetemperatur i et fugtigt kammer i ca. 5 minutter. Derefter blev det overskydende reagens skyllet med destilleret vand, og objektglassene blev farvet med hæmatoxylin (Thermo Scientific). Præparaterne blev dehydreret ved at udføre en serie på tre skift af alkohol og xylen i stigende koncentrationer. Lukkes med et dækglas (CYTOSEAL af ThermoScientific). Ekspression af hvert cytokin blev vurderet semikvantitativt som antallet af positive celler pr. kvadratmillimeter i den analyserede prøve, beregnet ved anvendelse af en billedanalysator.

IL-18 og histamin i blodet Serum IL-18 måling blev udført ved ELISA under anvendelse af human rekombinant IL-18 (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, katalognr. Orb50153). Blodprøver og reagenser blev opvarmet til 37 °C og derefter fortyndet 1:2 med fortyndingsmidlet under anvendelse af 50 µL buffer med fuldstændig og ensartet blanding. Opløsningen blev dispenseret 0,1 ml pr. brønd. Mikroliterpladen med brøndene blev dækket med et låg og inkuberet ved 37°C i 90 min. Pladen blev derefter tørret, 0,1 ml biotinyleret anti-humant IL-18 antistofopløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37°C i 60 minutter. Pladen blev derefter vasket tre gange i 0,01 M TBS (TRIS bufret saltvand), hver gang vaskebufferen blev efterladt i brønden i 1 min. Bufferen blev fjernet, og pladen blev tørret, derefter blev 0,1 ml fremstillet avidin-biotin-peroxidase (ABC) opløsning tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter. Pladen blev skyllet igen, denne gang 5 gange med 0,01 M TBS, og vaskebufferen blev efterladt i brøndene i 1-2 minutter hver gang. Bufferen blev fjernet, og pladen blev tørret, derefter blev 90 µl TMB-farvestof tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet ved 37°C i 10 minutter. 0,1 ml TMB kontrastfarveopløsning blev tilsat til hver brønd, og absorbansen blev straks målt ved 450 nm. Serumhistaminniveauer blev målt ved ELISA under anvendelse af Histamin ELISA Immundiagnostik-reagenset, katalognummer K 8212. Vaskebufferkoncentratet (WASHBUF B) blev fortyndet 1:10 i rent vand. Reagenser blev bragt til stuetemperatur. Plasmaprøverne blev blandet med derivatiseringsreagenset. Den derivatiserede prøve blev derefter inkuberet på en vandret rystemaskine sammen med et peroxidasemærket polyklonalt histaminantistof på en histaminderivatbelagt ELISA-plade i 1 time ved stuetemperatur. Derefter blev indholdet af brøndene vasket 5 gange med 250 µl af vaskebufferen. Efter det sidste trin blev resterende buffer fjernet med silkepapir. Derefter blev 100 μl substrat (SUB) pipetteret i hver brønd, inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. 100 µl af kontrastfarveopløsningen blev tilsat til hver brønd. Absorbansen blev målt umiddelbart ved 450 nm. Resultaterne er udtrykt i pikogram pr. milliliter.

Statistisk analyse. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Statistica-programmet (StatSoft 13.3). Shapiro-Wilk normalitetstesten af ​​de undersøgte variable og de præsenterede frekvensdiagrammer viste, at fordelingen af ​​variablerne ikke var normal. De ikke-parametriske Wald-Wolfowitz og U Mann-Whitney test blev brugt til at sammenligne undersøgelsesgruppen med kontrolgruppen. Signifikanstesten af ​​korrelationskoefficienten var baseret på statistikken for Elevens t-fordeling.