Tulehdusta edistävät sytokiinit ja implantaatioprosessi naisilla, joilla on primaarinen idiopaattinen hedelmättömyys

Lapsettomuus vaikuttaa noin 8–12 prosenttiin lisääntymisikäisistä pareista maailmanlaajuisesti, mikä vastaa yli 186 miljoonaa ihmistä.

Noin 20 %:lla pariskunnista hedelmättömyyden aiheuttajaa ei voida tunnistaa rutiinidiagnostisten testien jälkeen. Yksi idiopaattisen hedelmättömyyden syistä voi olla implantaatioprosessin häiriö.

Implantaatio voi tapahtua kuukautiskierron tietyssä vaiheessa, jolloin blastokystan kyky istuttaa on päällekkäin sen valmiuden kanssa ottaa se vastaan ​​kohdun limakalvon toimesta, ns. kohdun limakalvon vastaanotosta.

Aikaväliä, jonka aikana kohdun limakalvolla on tämä ominaisuus, kutsutaan implantaatioikkunaksi.

Implantaatioikkuna ihmisillä on 3–6 päivän ajanjakso, se osuu puoleen eritysvaiheesta – eli 6–10 päivää LH-huipun jälkeen.

Endometriumin vastaanottavuus heijastuu solu- ja rakennemuutoksina.

Prosesseja säätelevät hormonaalisesti munasarjaperäiset estrogeenit ja progesteroni. Lisäksi paikallisesti tuotetut signalointimolekyylit, kuten sytokiinit, kasvutekijät ja lipidivälittäjät autokriinin, parakriinin ja juxtacrine-signaloinnin kautta, ovat tärkeitä.

Geneettisesti vastaanottavaisia ​​ja päättäväisiä ohjaavat Hoxa10- ja Hoxa11-homeobox-geenit, joiden ilmentymistä lisää steroidihormonien toiminta. Solu- ja molekyylitason muutoksia kohdun limakalvon sisällä verrataan prosesseihin, kuten haavan paranemiseen ja matriisin hajoamiseen syövän invaasion aikana.

Endometriumiin tunkeutuvien immuunijärjestelmän solujen joukossa hallitsevat mononukleaariset solut: makrofagit, lymfosyytit ja NK-solut.

Pohdittaessa paikallisen tulehduksen roolia hedelmällisyydessä on olennaista erottaa akuutti ja krooninen keskivaikea tai matala intensiteetti.

Tulehdusvasteen akuutissa vaiheessa immuunijärjestelmän solut siirtyvät vauriokohtaan huolellisesti suunnitellussa tapahtumasarjassa, jota helpottavat liukoiset välittäjät, kuten sytokiinit, kemokiinit ja akuutin vaiheen proteiinit. Vamman vakavuudesta riippuen tämä akuutti vaihe voi olla riittävä korjaamaan vaurio ja käynnistämään paranemisprosessit.

Pitkittynyt tulehdus, joka johtuu pitkäaikaisesta altistumisesta stimulaatiolle tai sopimattomasta vasteesta omia kudoksia vastaan, voi johtaa krooniseen vaiheeseen, jossa voi esiintyä kudosvaurioita ja fibroosia.

Tietyssä tulehduksessa havaittujen molekyylien profiili riippuu tulehdusprosessin vakavuudesta, kestosta ja mekanismeista sekä kehon immuunijärjestelmän kyvystä reagoida ja sopeutua.

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, eroavatko valittujen tulehdusmolekyylien - interleukiini18 ja histamiini - tasot määrittelemättömän hedelmättömyyden omaavien naisten populaatiossa verrattuna naisiin, joilla on luonnollisesti syntyneitä jälkeläisiä.

Materiaalit ja menetelmät Prospektiivinen, poikkileikkaustutkimus suoritettiin. Tutkimussuunnitelma sai Jagiellonian yliopiston bioetiikkatoimikunnan myönteisen lausunnon nro 1072.6120.78.2017 29.6.2017. Varat on saatu tiede- ja korkeakouluministeriön apurahasta nro K / DSC / 00421. Tutkimusryhmä koostui 58 naisesta, joilla oli diagnosoitu primaarinen hedelmättömyys, ja kontrolliryhmä koostui 8 potilaasta, joilla oli luonnollisesti syntyneitä jälkeläisiä. Potilaat rekrytoitiin gynekologisen endokrinologian ja gynekologian klinikalla sairaalahoidossa olleiden, Gynekologisen endokrinologian klinikalla konsultoitujen ja kokonaisvaltaisen lisääntymisterveysohjelman puitteissa diagnosoitujen naisten joukosta marraskuusta 2017 maaliskuuhun 2020.

Tutkimusryhmän mukaanottokriteerit täyttivät lisääntymisiässä olevat (18-40-vuotiaat) naiset, jotka kärsivät primaarisesta hedelmättömyydestä (yrittivät tulla raskaaksi tuloksetta yli vuoden ajan), kuukautiset säännöllisesti, eivät käytä hormonihoitoa.

Poissulkemiskriteerit olivat: vahvistettu miespuolinen hedelmättömyystekijä, munanjohtimien tekijä, endometrioosi, lantion alueen tulehdus - tällä hetkellä ja historiassa, hedelmättömyyden hormonaalinen tausta, liikalihavuus, insuliiniresistenssi, tila vähintään yhden keskenmenon jälkeen ja krooniset autoimmuunisairaudet.

Kontrolliryhmän mukaanottokriteerit täyttivät lisääntymisiässä olevat (18-40-vuotiaat) potilaat, joilla oli luonnollisesti syntyneitä enintään kolmen vuoden ikäisiä jälkeläisiä, joilla oli säännölliset kuukautiset. Poissulkemiskriteerit olivat: kohtuleikkauksen jälkeinen tila, mukaan lukien kohdun ontelon kuretti, endometrioosi, lantion tulehdus - läsnä ja historiassa vähintään yksi keskenmeno, liikalihavuus, insuliiniresistenssi, krooniset autoimmuunisairaudet, imetys.

Molemmista tutkimukseen värvättyjen ryhmien potilaat tutkittiin implantaatioikkunan aikana. Sopiva syklin ajoitus määritettiin ultraääniovulaation seurannalla. Potilaat ilmoittivat noin 10. kierron päivänä tarkkailevansa hallitsevan follikkelin kasvua. Tutkimus toistettiin 3-4 päivän kuluttua. Jos hallitseva follikkelien kasvu varmistettiin, potilas teki virtsan LH-testin kotona 16 päivää ennen odotettua kuukautisten alkamista. Potilaat raportoivat 6-8 päivää LH-huipun jälkeen tai, jos testitulos on kyseenalainen, luteaalivaiheen puolivälissä kuukautiskierron raportoidulla pituudella - 8-4 päivää ennen odotettujen kuukautisten päivää. Vierailun aikana tehtiin ultraäänitutkimus menneen ovulaation varmentamiseksi (keltarauhasen tarkkailu identtisessä munasarjassa, kohdun limakalvon leveys vähintään 10 mm).

Potilaille kerrottiin yhdynnästä luopumisen välttämättömyydestä tutkimuksen suorittamissyklissä, mikä vahvistettiin tutkimusdokumentaatiossa. Potilaita, jotka eivät hyväksyneet tätä vaatimusta, ei voitu ottaa tutkimukseen. Ovulaation varmistuttua käynnin aikana tehtiin kohdun limakalvon aspiraatiobiopsia muovipipetillä, jonka halkaisija oli n. 3 mm (Pipelle Endometrial Suction Curette). Jos kohdunkaulan kanavaan tunkeutuminen pipetillä oli vaikeuksia, kohdunkaulan ylähuuleen tartuttiin puristimella. Jos potilaalla oli voimakasta kipua tai kyvyttömyys tunkeutua kohdunkaulan kanavaan, materiaalin kerääminen lopetettiin. Välittömästi tutkimuksen jälkeen potilaita pyydettiin arvioimaan kivun voimakkuus toimenpiteen aikana numeerisesti numeerisella arviointiasteikolla (NRS), jossa 0 ei ole kipua ollenkaan ja 10 on pahin kuviteltavissa oleva kipu. Yhdelläkään potilaalla ei ollut komplikaatioita. Kerätty kohdun limakalvonäyte säilytettiin liuoksessa, jossa oli 10 % neutraalia, puskuroitua formaliinia huoneenlämpötilassa, ja siirrettiin sitten CMUJ:n kliinisen ja kokeellisen patologian osastolle kiinnitettäväksi parafiinilohkoihin.

Samana päivänä jokaiselta potilaalta otettiin 5 ml:n laskimoverinäyte EDTA:lla. Verta sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 3000 rpm, ja seerumi lähetettiin Jagiellonian University Medical Collegen kliinisen biokemian osastolle IL-18- ja histamiinitasojen määrittämistä varten.

Immunohistokemia Kudosmateriaali kiinnitettiin formaldehydissä 24 tunnin ajan. Sitten se kuivattiin 70-prosenttisessa etanoliliuoksessa ja upotettiin sitten parafiiniin. Kudokset leikattiin 4 um paksuiksi ja kiinnitettiin silanoiduille objektilaseille. Osat jaettiin kolmeen yhtä suureen sarjaan. Parafiinivalmisteista poistettiin vaha (3 ksyleenin vaihtoa huoneenlämpötilassa; ensimmäinen vaihto - 10 minuuttia, toinen ja kolmas vaihto 15 minuutin kuluttua) ja rehydratoitiin (3 alkoholin vaihtoa huoneenlämpötilassa, kukin 5 minuuttia). Sitten valmisteita inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuuttia. 3-prosenttisessa H2O2-liuoksessa endogeenisen peroksidaasin estämiseksi. Objektilasit huuhdeltiin tislatulla vedellä ja inkuboitiin TBS:n kanssa 5 minuuttia. Sitten objektilasit peitettiin sitraattipuskurilla pH 6,0 vesihauteessa 97 °C:ssa. Valmisteiden paljastamisen jälkeen levitettiin Ultra Vision Protein Block -valmistetta (Thermo Scientific) 5 minuutin ajan. huoneenlämmössä kosteassa kammiossa. Sitten soveltuvaa vasta-ainetta levitettiin ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kosteassa kammiossa määrätyn ajan (taulukko 1). Ensimmäistä sarjaa leikkeitä inkuboitiin IL-18-reaktiivisten kanin polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa (Rekombinantti IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. nro PAA064HU01) laimennuksella 1:00 60 minuutin ajan. Toista sarjaa inkuboitiin histamiinireaktiivisten kanin polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa (Rekombinantti ihmisen histamiini (Met1 - Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, luettelonro. PAA927Ge01) laimennuksena 1:100 30 minuutin ajan. Kolmatta sarjaa inkuboitiin kanin polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa (Rekombinantti ihmisen GLUT4 (Met1 - Ile163) Cloud-Clone Corp., luettelonro. PAC023HU01) laimennuksella 1:50 30 minuutin ajan. Ylimääräinen vasta-aine pestiin TBS-puskurilla ja Post-vasta-aineesto Bright Vision plus -ohjelmalle (BrightVision + Goat anti-hiiri / kani HRP - ImmunoLogic Kit) käytettiin. Inkuboidaan kosteassa kammiossa huoneenlämmössä 20 minuuttia.

Ylimääräinen reagenssi pestiin pois TBS-puskurilla ja lisättiin poly-HRP-GAMs/Rb-IgG-valmistetta (BrightVision + Goat anti-hiiri/kani HRP - ImmunoLogic Kit). Inkuboidaan huoneenlämmössä kosteassa kammiossa 30 minuuttia. Ylimääräinen reagenssi pestiin pois TBS-puskurilla ja laitettiin DAB Quanto (Thermo Scientific). Inkuboidaan huoneenlämmössä kosteassa kammiossa noin 5 minuuttia. Sitten ylimääräinen reagenssi huuhdeltiin tislatulla vedellä ja objektilasit värjättiin hematoksyliinillä (Thermo Scientific). Valmisteet dehydratoitiin suorittamalla sarja kolme kertaa alkoholin ja ksyleenin vaihtoa kasvavissa pitoisuuksissa. Suljettu kansilasilla (CYTOSEAL, ThermoScientific). Kunkin sytokiinin ilmentyminen arvioitiin puolikvantitatiivisesti positiivisten solujen lukumääränä neliömillimetriä kohden analysoidussa näytteessä, laskettuna käyttämällä kuva-analysaattoria.

IL-18 ja histamiini veressä Seerumin IL-18-mittaus suoritettiin ELISA:lla käyttämällä ihmisen rekombinantti-IL-18:aa (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, luettelonro. Orb50153). Verinäytteet ja reagenssit lämmitettiin 37 °C:seen ja laimennettiin sitten suhteessa 1:2 laimentimella käyttämällä 50 ui puskuria täydellisellä ja tasaisella sekoituksella. Liuosta annosteltiin 0,1 ml per kuoppa. Mikrolitralevy kuoppineen peitettiin kannella ja inkuboitiin 37 °C:ssa 90 minuuttia. Sitten levy kuivattiin, jokaiseen kuoppaan lisättiin 0,1 ml biotinyloitua ihmisen IL-18:n vastaista vasta-aineliuosta ja inkuboitiin 37 °C:ssa 60 minuuttia. Levy pestiin sitten kolme kertaa 0,01 M TBS:ssä (TRIS-puskuroitu suolaliuos), joka kerta jättäen pesupuskuri kuoppaan 1 minuutiksi. Puskuri poistettiin ja levy kuivattiin, sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,1 ml valmistettua avidiini-biotiiniperoksidaasi (ABC) -liuosta ja levyä inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Levy huuhdeltiin uudelleen, tällä kertaa 5 kertaa 0,01 M TBS:llä, ja pesupuskuri jätettiin kuoppiin 1-2 minuutiksi joka kerta. Puskuri poistettiin ja levy kuivattiin, sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 90 ui TMB-väriä ja levyä inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuuttia. 0,1 ml TMB-kontrastiväriliuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja absorbanssi mitattiin välittömästi 450 nm:ssä. Seerumin histamiinitasot mitattiin ELISA:lla käyttämällä Histamin ELISA Immundiagnostik -reagenssia, luettelonumero K 8212. Pesupuskurikonsentraatti (WASHBUF B) laimennettiin 1:10 puhtaaseen veteen. Reagenssit saatettiin huoneenlämpötilaan. Plasmanäytteet sekoitettiin derivatisointireagenssin kanssa. Derivatisoitua näytettä inkuboitiin sitten vaakasuuntaisessa ravistelijassa yhdessä peroksidaasilla leimatun polyklonaalisen histamiinivasta-aineen kanssa histamiinijohdannaisella päällystetyllä ELISA-levyllä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten kuoppien sisältö pestiin 5 kertaa 250 ul:lla pesupuskuria. Viimeisen vaiheen jälkeen jäännöspuskuri poistettiin pehmopaperilla. Sitten jokaiseen kuoppaan pipetoitiin 100 μl substraattia (SUB), inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämmössä valolta suojattuna. 100 ui kontrastiväriliuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi mitattiin välittömästi 450 nm:ssä. Tulokset ilmaistaan ​​pikogrammeina millilitraa kohti.

Tilastollinen analyysi. Tilastollinen analyysi suoritettiin Statistica-ohjelmalla (StatSoft 13.3). Tutkittujen muuttujien Shapiro-Wilk-normaalisuustesti ja esitetyt taajuuskaaviot osoittivat, että muuttujien jakauma ei ollut normaali. Ei-parametrisiä Wald-Wolfowitzin ja U Mann-Whitneyn testejä käytettiin vertailemaan tutkimusryhmää kontrolliryhmään. Korrelaatiokertoimen merkitsevyystesti perustui Studentin t-jakauman tilastoihin.