Cytokines pro-inflammatoires et processus d'implantation chez les femmes atteintes d'infertilité idiopathique primaire

L'infertilité touche environ 8 à 12 % des couples en âge de procréer dans le monde, ce qui équivaut à plus de 186 millions de personnes.

Chez environ 20 % des couples, l'agent causal de l'infertilité ne peut être identifié après des tests de diagnostic de routine. L'une des causes de l'infertilité idiopathique peut être des troubles du processus d'implantation.

L'implantation peut avoir lieu à un moment précis du cycle menstruel, lorsque la capacité du blastocyste à s'implanter se chevauche avec la préparation à son acceptation par l'endomètre, la soi-disant réceptivité endométriale.

L'intervalle de temps pendant lequel l'endomètre présente cette propriété est appelé la fenêtre d'implantation.

La fenêtre d'implantation chez l'homme est une période de 3 à 6 jours, elle tombe sur la moitié de la phase sécrétoire - c'est-à-dire 6 à 10 jours après le pic de LH.

L'acquisition de la réceptivité par l'endomètre se traduit par des modifications cellulaires et structurelles.

Les processus sont contrôlés hormonalement par les œstrogènes et la progestérone d'origine ovarienne. De plus, les molécules de signalisation produites localement telles que les cytokines, les facteurs de croissance et les médiateurs lipidiques via la signalisation autocrine, paracrine et juxtacrine sont importantes.

Génétiquement réceptifs et décisifs, ils sont pilotés par les gènes homéobox Hoxa10 et Hoxa11, dont l'expression est augmentée par l'action des hormones stéroïdes. Les changements aux niveaux cellulaire et moléculaire dans l'endomètre sont comparés à des processus tels que la cicatrisation des plaies et la dégradation de la matrice au cours du processus d'invasion du cancer.

Parmi les cellules du système immunitaire infiltrant l'endomètre, les cellules mononucléaires dominent : macrophages, lymphocytes et cellules NK.

En considérant le rôle de l'inflammation locale dans la fertilité, il est essentiel de distinguer l'inflammation aiguë et chronique d'intensité modérée ou faible.

Dans la phase aiguë de la réponse inflammatoire, les cellules du système immunitaire migrent vers le site de la lésion selon une séquence d'événements soigneusement planifiée facilitée par des médiateurs solubles tels que les cytokines, les chimiokines et les protéines de phase aiguë. Selon la gravité de la blessure, cette phase aiguë peut être suffisante pour réparer les dommages et amorcer les processus de guérison.

Une inflammation prolongée, résultant d'une exposition prolongée à une stimulation ou d'une réponse inappropriée contre ses propres tissus, peut conduire à une phase chronique, au cours de laquelle des lésions tissulaires et une fibrose peuvent survenir.

Le profil des molécules observées dans une inflammation donnée dépend de la sévérité, de la durée et des mécanismes impliqués dans le processus inflammatoire, ainsi que de la capacité du système immunitaire de l'organisme à réagir et à s'adapter.

Le but de l'étude était d'étudier si les niveaux de molécules inflammatoires sélectionnées - l'interleukine18 et l'histamine, diffèrent dans la population de femmes atteintes d'infertilité indéterminée par rapport aux femmes ayant une progéniture conçue naturellement.

Matériels et méthodes Une étude prospective transversale a été réalisée. La conception de l'étude a reçu un avis positif du comité de bioéthique de l'Université Jagellonne n ° 1072.6120.78.2017 en date du 29 juin 2017 Les fonds ont été obtenus de la subvention n ° K / DSC / 00421 du ministère des sciences et de l'enseignement supérieur. Le groupe d'étude était composé de 58 femmes diagnostiquées avec une infertilité primaire, et un groupe témoin était composé de 8 patients ayant une progéniture conçue naturellement. Les patientes ont été recrutées parmi les femmes hospitalisées à la Clinique d'Endocrinologie Gynécologique et de Gynécologie, consultées à la Clinique d'Endocrinologie Gynécologique et diagnostiquées dans le cadre du Programme Intégré de Santé Reproductive dans la période de novembre 2017 à mars 2020.

Les critères d'inclusion pour le groupe d'étude étaient remplis par des femmes en âge de procréer (18-40 ans) souffrant d'infertilité primaire (tentant sans succès de tomber enceinte pendant plus d'un an), menstruant régulièrement, n'utilisant pas d'hormonothérapie.

Les critères d'exclusion étaient : facteur masculin d'infertilité établi, facteur tubaire, endométriose, inflammation de la région pelvienne - actuelle et dans les antécédents, antécédents hormonaux d'infertilité, obésité, résistance à l'insuline, statut après au moins une fausse couche et maladies auto-immunes chroniques.

Les critères d'inclusion pour le groupe témoin étaient remplis par les patientes en âge de procréer (18-40 ans) avec une progéniture conçue naturellement jusqu'à l'âge de trois ans, avec des menstruations régulières. Les critères d'exclusion étaient : état après chirurgie de l'utérus, y compris curetage de la cavité utérine, endométriose, inflammation pelvienne - présente et dans les antécédents, au moins une fausse couche, obésité, résistance à l'insuline, maladies auto-immunes chroniques, allaitement.

Les patients des deux groupes recrutés pour l'étude ont été examinés pendant la fenêtre d'implantation. Le moment approprié du cycle a été déterminé par la surveillance de l'ovulation par ultrasons. Les patients ont signalé vers le 10e jour du cycle avoir observé la croissance du follicule dominant. L'examen a été répété après 3-4 jours. Si la croissance folliculaire dominante était confirmée, la patiente effectuait un test urinaire de LH à domicile 16 jours avant le début prévu des menstruations. Les patientes ont signalé 6 à 8 jours après le pic de LH ou, en cas de résultat de test douteux, au milieu de la phase lutéale déterminée par la durée rapportée des cycles menstruels - 8 à 4 jours avant le jour de la période prévue. Lors de la visite, un examen échographique a été réalisé pour confirmer l'ovulation passée (observation du corps jaune dans un ovaire identique, endomètre d'au moins 10 mm de large).

Les patients ont été informés de la nécessité d'abandonner les rapports sexuels dans le cycle au cours duquel l'étude a été menée, ce qui a été confirmé dans la documentation de l'étude. Les patients qui n'acceptaient pas cette exigence ne pouvaient pas être admis à l'étude. Au cours de la visite, après confirmation de l'ovulation, une biopsie par aspiration de l'endomètre a été réalisée à l'aide d'une pipette en plastique d'un diamètre d'env. 3 mm (Curette d'aspiration endométriale Pipelle). S'il y avait des difficultés à pénétrer le canal cervical avec une pipette, la lèvre supérieure du col était saisie avec une pince. En cas de douleur intense chez le patient ou d'incapacité à pénétrer dans le canal cervical, la collecte du matériel a été interrompue. Immédiatement après l'examen, les patients ont été invités à évaluer numériquement l'intensité de la douleur pendant la procédure sur l'échelle d'évaluation numérique (NRS), où 0 correspond à aucune douleur et 10 à la pire douleur imaginable. Il n'y a eu aucune complication chez aucun des patients. L'échantillon d'endomètre collecté a été conservé dans une solution de formol tamponné neutre à 10 % à température ambiante, puis transféré au service de pathologie clinique et expérimentale du CMUJ pour fixation dans des blocs de paraffine.

Le même jour, un échantillon de 5 ml de sang veineux sur EDTA a été prélevé chez chaque patient. Le sang a été centrifugé pendant 15 minutes à 3 000 tr/min et le sérum a été envoyé au Département de biochimie clinique du Jagiellonian University Medical College pour la détermination des taux d'IL-18 et d'histamine.

Immunohistochimie Le matériel tissulaire a été fixé dans du formaldéhyde pendant 24 heures. Ensuite, il a été déshydraté dans une solution d'éthanol à 70% puis inclus dans de la paraffine. Les tissus ont été sectionnés à 4 µm d'épaisseur et montés sur des lames silanisées. Les sections ont été divisées en trois ensembles égaux. Les préparations de paraffine ont été déparaffinées (3 échanges de xylène à température ambiante ; le premier échange - 10 minutes, les deuxième et troisième échanges après 15 minutes) et réhydratées (3 échanges d'alcool à température ambiante, 5 minutes chacun). Ensuite, les préparations ont été incubées à température ambiante pendant 10 min. dans une solution de H2O2 à 3 % pour bloquer la peroxydase endogène. Les lames ont été rincées à l'eau distillée et incubées avec du TBS pendant 5 minutes. Puis les lames ont été démasquées avec du tampon citrate pH 6,0 dans un bain marie à 97°C. Une fois les préparations démasquées, la préparation Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific) a été appliquée pendant 5 min. à température ambiante dans une chambre humide. Ensuite, l'anticorps approprié a été appliqué et incubé à température ambiante dans une chambre humide pendant un temps spécifié (tableau 1). Le premier jeu de coupes a été incubé avec des anticorps polyclonaux de lapin réactifs à l'IL-18 (Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. n°PAA064HU01) à une dilution de 1:00 pendant 60 min. Le deuxième ensemble a été incubé avec des anticorps polyclonaux de lapin réactifs à l'histamine (histamine humaine recombinante (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg / ml, catalogue no. PAA927Ge01) à une dilution de 1 : 100 pendant 30 min. Le troisième ensemble a été incubé avec des anticorps polyclonaux de lapin (Recombinant human GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., catalogue no. PAC023HU01) à une dilution de 1:50 pendant 30 min. L'excès d'anticorps a été lavé avec du tampon TBS et un post-blocage d'anticorps pour Bright Vision plus (BrightVision + chèvre anti-souris / lapin HRP - kit ImmunoLogic) a été appliqué. Nous incubons en chambre humide à température ambiante pendant 20 minutes.

L'excès de réactif a été lavé avec du tampon TBS et une préparation poly-HRP-GAMs / Rb IgG (BrightVision + chèvre anti-souris / lapin HRP - kit ImmunoLogic) a été appliquée. Incubation à température ambiante en chambre humide pendant 30 minutes. L'excès de réactif a été lavé avec du tampon TBS et du DAB Quanto (Thermo Scientific) a été appliqué. Incubé à température ambiante dans une chambre humide pendant environ 5 minutes. Ensuite, l'excès de réactif a été rincé à l'eau distillée et les lames ont été colorées à l'hématoxyline (Thermo Scientific). Les préparations ont été déshydratées en procédant à une série de trois changements d'alcool et de xylène à des concentrations croissantes. Fermé par une lamelle (CYTOSEAL de ThermoScientific). L'expression de chaque cytokine a été évaluée de manière semi-quantitative en tant que nombre de cellules positives par millimètre carré dans l'échantillon analysé, calculé à l'aide d'un analyseur d'images.

IL-18 et histamine dans le sang La mesure de l'IL-18 sérique a été réalisée par ELISA en utilisant de l'IL-18 humaine recombinante (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, catalogue no. Orb50153). Les échantillons de sang et les réactifs ont été réchauffés à 37 ° C puis dilués 1: 2 avec le diluant en utilisant 50 µL de tampon avec un mélange complet et uniforme. La solution a été distribuée à raison de 0,1 ml par puits. La microplaque avec les puits a été recouverte d'un couvercle et incubée à 37°C pendant 90 min. La plaque a ensuite été séchée, 0,1 ml d'une solution d'anticorps anti-IL-18 humaine biotinylée a été ajoutée dans chaque puits et incubée à 37°C pendant 60 min. La plaque a ensuite été lavée trois fois dans du TBS 0,01 M (solution saline tamponnée TRIS), en laissant à chaque fois le tampon de lavage dans le puits pendant 1 min. Le tampon a été retiré et la plaque a été séchée, puis 0,1 ml de solution préparée d'avidine-biotine-peroxydase (ABC) a été ajouté à chaque puits et la plaque a été incubée à 37°C pendant 30 min. La plaque a été rincée à nouveau, cette fois 5 fois avec du TBS 0,01 M, et le tampon de lavage a été laissé dans les puits pendant 1 à 2 min à chaque fois. Le tampon a été retiré et la plaque a été séchée, puis 90 µl de colorant TMB ont été ajoutés à chaque puits et la plaque a été incubée à 37°C pendant 10 min. 0,1 ml de solution de colorant de contraste TMB a été ajouté à chaque puits et l'absorbance a été immédiatement mesurée à 450 nm. Les taux sériques d'histamine ont été mesurés par ELISA en utilisant le réactif Histamin ELISA Immundiagnostik, numéro de catalogue K 8212. Le concentré de tampon de lavage (WASHBUF B) a été dilué au 1:10 dans de l'eau pure. Les réactifs ont été ramenés à température ambiante. Les échantillons de plasma ont été mélangés avec le réactif de dérivation. L'échantillon dérivé a ensuite été incubé sur un agitateur horizontal avec un anticorps d'histamine polyclonal marqué à la peroxydase sur une plaque ELISA revêtue de dérivé d'histamine pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, le contenu des puits a été lavé 5 fois avec 250 ul de tampon de lavage. Après la dernière étape, le tampon résiduel a été éliminé avec du papier de soie. Puis 100 µl de substrat (SUB) ont été pipetés dans chaque puits, incubés 15 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. 100 ul de la solution de colorant de contraste ont été ajoutés à chaque puits. L'absorbance a été mesurée immédiatement à 450 nm. Les résultats sont exprimés en picogrammes par millilitre.

Analyses statistiques. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du programme Statistica (StatSoft 13.3). Le test de normalité de Shapiro-Wilk des variables examinées et les tableaux de fréquence présentés ont montré que la distribution des variables n'était pas normale. Les tests non paramétriques de Wald-Wolfowitz et U Mann-Whitney ont été utilisés pour comparer le groupe d'étude au groupe témoin. Le test de signification du coefficient de corrélation était basé sur les statistiques de la distribution t de Student.