原发性特发性不孕症女性的促炎细胞因子和着床过程

不孕症影响了全球约 8% 至 12% 的育龄夫妇，相当于超过 1.86 亿人。

在大约 20% 的夫妇中，通过常规诊断测试无法确定不孕症的病原体。 特发性不育的原因之一可能是着床过程的障碍。

着床可以发生在月经周期的特定时间点，此时胚泡的着床能力与子宫内膜接受它的准备程度重叠，即所谓的子宫内膜容受性。

子宫内膜表现出这种特性的时间间隔称为着床窗。

人类的植入窗口期为 3 至 6 天，它处于分泌期的一半 - 即 LH 峰值后的 6 至 10 天。

子宫内膜获得容受性反映在细胞和结构变化上。

这些过程由卵巢来源的雌激素和黄体酮激素控制。 此外，局部产生的信号分子如细胞因子、生长因子和通过自分泌、旁分泌和近分泌信号传导的脂质介质也很重要。

遗传接受性和决定性由 Hoxa10 和 Hoxa11 同源框基因驱动，类固醇激素的作用会增加其表达。 将子宫内膜内细胞和分子水平的变化与癌症侵袭过程中的伤口愈合和基质降解等过程进行比较。

在浸润子宫内膜的免疫系统细胞中，单核细胞占主导地位：巨噬细胞、淋巴细胞和 NK 细胞。

在考虑局部炎症对生育能力的影响时，必须区分中等或低强度的急性和慢性炎症。

在炎症反应的急性期，免疫系统的细胞在可溶性介质（如细胞因子、趋化因子和急性期蛋白）的推动下，按照精心计划的一系列事件迁移到损伤部位。 根据损伤的严重程度，这个急性期可能足以修复损伤并启动愈合过程。

由于长时间暴露于刺激或对自身组织的不适当反应，长期炎症可导致慢性期，其中可能发生组织损伤和纤维化。

在给定炎症中观察到的分子概况取决于炎症过程的严重程度、持续时间和机制，以及身体免疫系统的反应和适应能力。

该研究的目的是调查选定的炎症分子 - 白细胞介素 18 和组胺的水平，与自然受孕后代的女性相比，不确定不孕症的女性人群中是否存在差异。

材料和方法 进行了一项前瞻性横断面研究。 研究设计获得雅盖隆大学生物伦理委员会 2017 年 6 月 29 日第 1072.6120.78.2017 号的肯定意见 资金来自科学和高等教育部第 K / DSC / 00421 号拨款。 研究组由 58 名诊断为原发性不孕症的女性组成，对照组由 8 名自然受孕后代的患者组成。 患者是从 2017 年 11 月至 2020 年 3 月期间在妇科内分泌科和妇科门诊住院、在妇科内分泌科门诊咨询并根据综合生殖健康计划诊断的女性中招募的。

符合研究组的纳入标准的育龄妇女（18-40 岁）患有原发性不孕症（尝试怀孕失败超过一年），月经规律，未使用激素治疗。

排除标准是：确定的不育男性因素、输卵管因素、子宫内膜异位症、骨盆区域炎症——目前和历史上、不孕的激素背景、肥胖、胰岛素抵抗、至少一次流产后的状态和慢性自身免疫性疾病。

对照组的纳入标准由育龄（18-40 岁）且自然受孕后代达三岁、月经规律的患者满足。 排除标准是：子宫手术后的状况，包括宫腔刮除术、子宫内膜异位症、盆腔炎症——目前和历史上至少有一次流产、肥胖、胰岛素抵抗、慢性自身免疫性疾病、母乳喂养。

为研究招募的两组患者均在植入窗口期间接受了检查。 周期的适当时间由超声排卵监测确定。 患者在周期的第 10 天左右报告观察了优势卵泡的生长。 3-4天后重复检查。 如果确认了优势卵泡生长，则患者在预期月经开始前 16 天在家中进行了尿液 LH 检测。 患者在 LH 峰值后 6-8 天报告，或者在有疑问的测试结果的情况下，在由报告的月经周期长度确定的黄体期中间 - 预计月经前 8-4 天。 就诊期间，进行了超声检查以确认过去的排卵（观察同一卵巢中的黄体，子宫内膜至少 10 毫米宽）。

患者被告知有必要在进行研究的周期中放弃性交，这在研究文件中得到了证实。 不接受此要求的患者不能被纳入研究。 访视期间，在确认排卵后，使用直径约0.5mm的塑料吸管进行子宫内膜穿刺活检。 3 毫米（Pipelle 子宫内膜抽吸器）。 如果移液管难以穿透宫颈管，则用夹子夹住宫颈上唇。 在患者剧烈疼痛或无法穿透宫颈管的情况下，停止收集材料。 检查后，立即要求患者在数字评定量表 (NRS) 上对手术过程中的疼痛强度进行评分，其中 0 表示完全没有疼痛，10 表示可以想象到的最严重的疼痛。 所有患者均未出现并发症。 收集的子宫内膜样本在室温下保存在 10% 中性福尔马林缓冲溶液中，然后转移到 CMUJ 临床和实验病理学部门进行石蜡块固定。

同一天，从每位患者身上采集 5 ml EDTA 静脉血样。 将血液以3000rpm离心15分钟，将血清送至雅盖隆大学医学院临床生物化学系进行IL-18和组胺水平的测定。

免疫组织化学组织材料在甲醛中固定 24 小时。 然后用70%乙醇溶液脱水，石蜡包埋。 将组织切成 4 µm 厚并安装在硅烷化载玻片上。 这些部分被分成三个相等的组。 将石蜡制剂脱蜡（在室温下进行 3 次二甲苯交换；第一次交换 - 10 分钟，在 15 分钟后进行第二次和第三次交换）并再水化（在室温下进行 3 次酒精交换，每次 5 分钟）。 然后将制剂在室温下孵育 10 分钟。 在 3% H2O2 溶液中以阻断内源性过氧化物酶。 载玻片在蒸馏水中漂洗并与 TBS 一起孵育 5 分钟。 然后在 97°C 的水浴中用 pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液暴露载玻片。 准备工作揭开后，使用 Ultra Vision Protein Block 准备工作（Thermo Scientific）5 分钟。 在室温下在潮湿的房间里。 然后应用适当的抗体并在室温下在潮湿室中孵育指定时间（表 1）。 第一组切片与 IL-18 反应性兔多克隆抗体（Recombinant IL18 (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0.33 mg/ml Cat. No. PAA064HU01) 以 1:00 稀释 60 分钟。 第二组与组胺反应性兔多克隆抗体（重组人组胺（Met1~Ile163），Cloud-Clone Corp.，0.35mg / ml，目录号。 PAA927Ge01) 1:100 稀释 30 分钟。 第三组与兔多克隆抗体（重组人 GLUT4（Met1 ~ Ile163）Cloud-Clone Corp.，目录号 PAC023HU01) 以 1:50 稀释 30 分钟。 用 TBS 缓冲液洗涤过量抗体，并应用 Bright Vision plus 的后抗体阻断（BrightVision + 山羊抗小鼠/兔 HRP - ImmunoLogic 试剂盒）。 我们在室温下的潮湿室中孵育 20 分钟。

用 TBS 缓冲液洗掉多余的试剂，并应用聚 HRP-GAMs/Rb IgG 制剂（BrightVision + 山羊抗小鼠/兔 HRP - ImmunoLogic 试剂盒）。 在室温下在潮湿箱中孵育 30 分钟。 用 TBS 缓冲液洗掉多余的试剂，然后使用 DAB Quanto (Thermo Scientific)。 在室温下在潮湿箱中孵育约 5 分钟。 然后，用蒸馏水冲洗多余的试剂，并用苏木精 (Thermo Scientific) 对载玻片进行染色。 通过以递增的浓度进行一系列的三个醇和二甲苯变化来使制剂脱水。 用盖玻片（ThermoScientific 的 CYTOSEAL）封闭。 每种细胞因子的表达半定量评估为分析样品中每平方毫米的阳性细胞数，使用图像分析仪计算。

IL-18 和血液中的组胺 血清 IL-18 测量是通过 ELISA 使用人重组 IL-18（人 IL-18 ELISA 试剂盒，Biorbyt，目录号 Orb50153）。 将血样和试剂加热至 37°C，然后用 50 µL 缓冲液与稀释剂按 1:2 稀释，充分均匀混合。 溶液每孔分配 0.1 毫升。 将带孔的微量滴定板盖上盖子，37℃孵育90分钟。 然后将板干燥，每孔加入0.1ml生物素化抗人IL-18抗体溶液，37℃孵育60分钟。 然后将板在 0.01 M TBS（TRIS 缓冲盐水）中洗涤 3 次，每次将洗涤缓冲液留在孔中 1 分钟。 去除缓冲液并干燥板，然后将0.1ml制备的亲和素-生物素-过氧化物酶（ABC）溶液加入每个孔中，并将板在37℃下孵育30分钟。 再次冲洗板，这次用 0.01 M TBS 冲洗 5 次，每次将洗涤缓冲液留在孔中 1-2 分钟。 去除缓冲液并干燥板，然后向每个孔中加入 90 μl TMB 染料，并将板在 37°C 下孵育 10 分钟。 每孔加入0.1 ml TMB对比染料溶液，立即在450 nm处测量吸光度。 使用目录号 K 8212 的组胺 ELISA Immundiagnostik 试剂通过 ELISA 测量血清组胺水平。 浓缩洗涤缓冲液 (WASHBUF B) 在纯水中按 1:10 稀释。 使试剂达到室温。 将血浆样品与衍生化试剂混合。 然后将衍生化的样品与过氧化物酶标记的多克隆组胺抗体一起在水平振荡器上在组胺衍生物包被的ELISA板上在室温下孵育1小时。 然后用 250 µl 洗涤缓冲液将孔中的内容物洗涤 5 次。 最后一步后，用薄纸去除残留的缓冲液。 然后将 100 μl 底物 (SUB) 移入每个孔中，在室温下孵育 15 分钟，避光。向每个孔中加入 100 µl 对比染料溶液。 立即在 450 nm 处测量吸光度。 结果以皮克每毫升表示。

统计分析。 使用 Statistica 程序 (StatSoft 13.3) 进行统计分析。 所检查变量的 Shapiro-Wilk 正态性检验和呈现的频率图表明变量的分布不正常。 非参数 Wald-Wolfowitz 和 U Mann-Whitney 检验用于比较研究组和对照组。 相关系数的显着性检验基于Student's t-分布的统计。