Citocinas proinflamatorias y proceso de implantación en mujeres con infertilidad idiopática primaria

La infertilidad afecta aproximadamente del 8 al 12% de las parejas en edad reproductiva en todo el mundo, lo que equivale a más de 186 millones de personas.

En aproximadamente el 20% de las parejas, el agente causal de la infertilidad no se puede identificar después de las pruebas de diagnóstico de rutina. Una de las causas de la infertilidad idiopática pueden ser los trastornos del proceso de implantación.

La implantación puede tener lugar en un punto específico del ciclo menstrual, cuando la capacidad del blastocisto para implantarse se superpone con la disposición para su aceptación por el endometrio, la denominada receptividad endometrial.

El intervalo de tiempo en el que el endometrio exhibe esta propiedad se denomina ventana de implantación.

La ventana de implantación en humanos es un período de 3 a 6 días, cae en la mitad de la fase secretora, es decir, 6 a 10 días después del pico de LH.

La adquisición de receptividad por parte del endometrio se refleja en cambios celulares y estructurales.

Los procesos están controlados hormonalmente por estrógenos y progesterona de origen ovárico. Además, son importantes las moléculas de señalización producidas localmente, como las citocinas, los factores de crecimiento y los mediadores lipídicos a través de la señalización autocrina, paracrina y yuxtacrina.

Genéticamente receptivos y resolutivos son impulsados ​​por los genes homeobox Hoxa10 y Hoxa11, cuya expresión se ve incrementada por la acción de las hormonas esteroides. Los cambios a nivel celular y molecular dentro del endometrio se comparan con procesos como la cicatrización de heridas y la degradación de la matriz durante el proceso de invasión del cáncer.

Entre las células del sistema inmunitario que infiltran el endometrio dominan las células mononucleares: macrófagos, linfocitos y células NK.

Al considerar el papel de la inflamación local en la fertilidad, es esencial distinguir entre inflamación aguda y crónica de intensidad moderada o baja.

En la fase aguda de la respuesta inflamatoria, las células del sistema inmunitario migran al sitio de la lesión en una secuencia cuidadosamente planificada de eventos facilitados por mediadores solubles como citocinas, quimiocinas y proteínas de fase aguda. Dependiendo de la gravedad de la lesión, esta fase aguda puede ser suficiente para reparar el daño e iniciar los procesos de curación.

La inflamación prolongada, como resultado de una exposición prolongada a la estimulación o una respuesta inadecuada contra los propios tejidos, puede conducir a una fase crónica, en la que puede producirse daño tisular y fibrosis.

El perfil de las moléculas que se observan en una determinada inflamación depende de la gravedad, la duración y los mecanismos implicados en el proceso de inflamación, así como de la capacidad del sistema inmunitario del organismo para responder y adaptarse.

El objetivo del estudio fue investigar si los niveles de moléculas inflamatorias seleccionadas, interleucina 18 e histamina, difieren en la población de mujeres con infertilidad indeterminada en comparación con las mujeres con descendencia concebida naturalmente.

Materiales y métodos Se realizó un estudio transversal prospectivo. El diseño del estudio recibió dictamen positivo del Comité de Bioética de la Universidad Jagellónica N° 1072.6120.78.2017 con fecha 29 de junio de 2017 Los fondos se obtuvieron de la subvención N° K/DSC/00421 del Ministerio de Ciencia y Educación Superior. El grupo de estudio consistió en 58 mujeres diagnosticadas con infertilidad primaria y un grupo de control consistió en 8 pacientes con descendencia concebida naturalmente. Las pacientes fueron reclutadas entre mujeres hospitalizadas en la Clínica de Endocrinología Ginecológica y Ginecología, consultadas en la Clínica de Endocrinología Ginecológica y diagnosticadas bajo el Programa Integral de Salud Reproductiva en el período de noviembre de 2017 a marzo de 2020.

Los criterios de inclusión para el grupo de estudio fueron cumplidos por mujeres en edad reproductiva (18-40 años) que sufrían de infertilidad primaria (intentar sin éxito quedar embarazada durante más de un año), menstruar regularmente y no usar terapia hormonal.

Los criterios de exclusión fueron: factor masculino de infertilidad establecido, factor tubárico, endometriosis, inflamación en el área pélvica actual y en la historia, antecedentes hormonales de infertilidad, obesidad, resistencia a la insulina, estado posterior a al menos un aborto espontáneo y enfermedades autoinmunes crónicas.

Los criterios de inclusión para el grupo control fueron cumplidos por pacientes en edad reproductiva (18-40 años) con descendencia naturalmente concebida hasta los tres años de edad, con menstruación regular. Los criterios de exclusión fueron: condición después de la cirugía en el útero, incluido el legrado de la cavidad uterina, endometriosis, inflamación pélvica - presente y en la historia, al menos un aborto espontáneo, obesidad, resistencia a la insulina, enfermedades autoinmunes crónicas, lactancia materna.

Los pacientes de ambos grupos reclutados para el estudio fueron examinados durante la ventana de implantación. El momento apropiado del ciclo se determinó mediante el control de la ovulación por ultrasonido. Los pacientes informaron alrededor del día 10 del ciclo para observar el crecimiento del folículo dominante. El examen se repitió después de 3-4 días. Si se confirmaba el crecimiento del folículo dominante, la paciente realizaba una prueba de LH en orina en casa 16 días antes del inicio esperado de la menstruación. Los pacientes informaron 6-8 días después del pico de LH o, en caso de resultados cuestionables de la prueba, en medio de la fase lútea determinada por la duración informada de los ciclos menstruales: 8-4 días antes del día del período esperado. Durante la visita, se realizó una ecografía para confirmar la ovulación pasada (observación del cuerpo lúteo en un ovario idéntico, endometrio de al menos 10 mm de ancho).

Los pacientes fueron informados sobre la necesidad de abandonar las relaciones sexuales en el ciclo en el que se realizó el estudio, lo que se confirmó en la documentación del estudio. Los pacientes que no aceptaron este requisito no pudieron ser admitidos al estudio. Durante la visita, después de confirmar la ovulación, se realizó una biopsia por aspiración endometrial utilizando una pipeta de plástico con un diámetro de aprox. 3 mm (Pipelle Endometrial Suction Cureta). Si había dificultades para penetrar el canal cervical con una pipeta, se sujetaba el labio superior del cuello uterino con una pinza. En el caso de dolor severo en el paciente o la imposibilidad de penetrar el canal cervical, se suspendía la recolección del material. Inmediatamente después del examen, se pidió a los pacientes que calificaran numéricamente la intensidad del dolor durante el procedimiento en la escala de calificación numérica (NRS), donde 0 es ningún dolor y 10 es el peor dolor imaginable. No hubo complicaciones en ninguno de los pacientes. La muestra de endometrio recolectada se conservó en una solución de formalina tamponada neutra al 10% a temperatura ambiente y luego se transfirió al Departamento de Patología Clínica y Experimental del CMUJ para su fijación en bloques de parafina.

El mismo día, se recogió una muestra de sangre venosa de 5 ml en EDTA de cada paciente. La sangre se centrifugó durante 15 minutos a 3000 rpm y el suero se envió al Departamento de Bioquímica Clínica del Colegio Médico de la Universidad Jagiellonian para la determinación de los niveles de IL-18 e histamina.

Inmunohistoquímica El material tisular se fijó en formaldehído durante 24 horas. Luego se deshidrató en solución de etanol al 70% y luego se embebió en parafina. Los tejidos se seccionaron con un grosor de 4 µm y se montaron en portaobjetos silanizados. Las secciones se dividieron en tres conjuntos iguales. Las preparaciones de parafina se desparafinaron (3 intercambios de xileno a temperatura ambiente; el primer intercambio - 10 minutos, el segundo y tercer intercambio después de 15 minutos) y se rehidrataron (3 intercambios de alcohol a temperatura ambiente, 5 minutos cada uno). Luego, las preparaciones se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. en una solución de H2O2 al 3% para bloquear la peroxidasa endógena. Los portaobjetos se enjuagaron en agua destilada y se incubaron con TBS durante 5 minutos. Luego los portaobjetos se desenmascararon con tampón citrato pH 6.0 en baño maría a 97°C. Después de desenmascarar las preparaciones, se aplicó la preparación Ultra Vision Protein Block (Thermo Scientific) durante 5 min. a temperatura ambiente en cámara húmeda. Luego se aplicó el anticuerpo apropiado y se incubó a temperatura ambiente en una cámara húmeda durante un tiempo específico (Tabla 1). El primer conjunto de secciones se incubó con anticuerpos policlonales de conejo reactivos con IL-18 (IL18 recombinante (Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0,33 mg/ml Cat. No. PAA064HU01) a una dilución de 1:00 durante 60 min. El segundo conjunto se incubó con anticuerpos policlonales de conejo reactivos con histamina (histamina humana recombinante (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0,35 mg/ml, catálogo no. PAA927Ge01) a una dilución de 1:100 durante 30 min. El tercer conjunto se incubó con anticuerpos policlonales de conejo (GLUT4 humano recombinante (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., catálogo no. PAC023HU01) a una dilución de 1:50 durante 30 min. El exceso de anticuerpo se lavó con tampón TBS y se aplicó el bloqueo posterior de anticuerpos para Bright Vision plus (BrightVision + cabra anti-ratón/conejo HRP - kit ImmunoLogic). Incubamos en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 20 minutos.

El exceso de reactivo se lavó con tampón TBS y se aplicó una preparación de poli-HRP-GAMs/Rb IgG (BrightVision + cabra anti-ratón/conejo HRP - kit ImmunoLogic). Incubar a temperatura ambiente en cámara húmeda durante 30 minutos. El exceso de reactivo se lavó con tampón TBS y se aplicó DAB Quanto (Thermo Scientific). Se incuba a temperatura ambiente en cámara húmeda durante unos 5 minutos. Luego, el exceso de reactivo se enjuagó con agua destilada y los portaobjetos se colorearon con hematoxilina (Thermo Scientific). Las preparaciones se deshidrataron realizando una serie de tres cambios de alcohol y xileno en concentraciones crecientes. Cerrado con cubreobjetos (CYTOSEAL de ThermoScientific). La expresión de cada citoquina se evaluó semicuantitativamente como el número de células positivas por milímetro cuadrado en la muestra analizada, calculado usando un analizador de imágenes.

IL-18 e histamina en la sangre La medición de IL-18 en suero se realizó mediante ELISA usando IL-18 recombinante humana (Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, catálogo no. Orbe50153). Las muestras de sangre y los reactivos se calentaron a 37°C y luego se diluyeron 1:2 con el diluyente utilizando 50 µL de tampón con mezclado completo y uniforme. La solución se dispensó 0,1 ml por pocillo. La placa de microlitros con los pocillos se cubrió con una tapa y se incubó a 37 °C durante 90 min. A continuación, la placa se secó, se añadió a cada pocillo 0,1 ml de solución de anticuerpo biotinilado anti-IL-18 humana y se incubó a 37 °C durante 60 min. A continuación, la placa se lavó tres veces en TBS 0,01 M (solución salina tamponada con TRIS), dejando cada vez el tampón de lavado en el pocillo durante 1 min. Se retiró el tampón y se secó la placa, luego se añadió a cada pocillo 0,1 ml de solución de avidina-biotina-peroxidasa (ABC) preparada y se incubó la placa a 37°C durante 30 min. La placa se enjuagó de nuevo, esta vez 5 veces con TBS 0,01 M, y el tampón de lavado se dejó en los pocillos durante 1-2 min cada vez. Se retiró el tampón y se secó la placa, luego se añadieron 90 µl de colorante TMB a cada pocillo y se incubó la placa a 37°C durante 10 min. Se añadió 0,1 ml de solución de colorante de contraste TMB a cada pocillo y se midió inmediatamente la absorbancia a 450 nm. Los niveles de histamina en suero se midieron mediante ELISA utilizando el reactivo Histamin ELISA Immundiagnostik, número de catálogo K 8212. El concentrado de tampón de lavado (WASHBUF B) se diluyó 1:10 en agua pura. Los reactivos se llevaron a temperatura ambiente. Las muestras de plasma se mezclaron con el reactivo de derivatización. A continuación, la muestra derivatizada se incubó en un agitador horizontal junto con un anticuerpo de histamina policlonal marcado con peroxidasa en una placa ELISA recubierta con derivado de histamina durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, el contenido de los pocillos se lavó 5 veces con 250 µl del tampón de lavado. Después del último paso, el tampón residual se eliminó con papel tisú. Luego se pipetearon 100 μl de sustrato (SUB) en cada pocillo, se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Se agregaron 100 µl de la solución de colorante de contraste a cada pocillo. La absorbancia se midió inmediatamente a 450 nm. Los resultados se expresan en picogramos por mililitro.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa Statistica (StatSoft 13.3). La prueba de normalidad de Shapiro-Wilk de las variables examinadas y los gráficos de frecuencia presentados mostraron que la distribución de las variables no era normal. Se utilizaron las pruebas no paramétricas de Wald-Wolfowitz y U Mann-Whitney para comparar el grupo de estudio con el grupo control. La prueba de significación del coeficiente de correlación se basó en las estadísticas de la distribución t de Student.