원발성 특발성 불임 여성의 전 염증성 사이토 카인 및 이식 과정

불임은 전 세계 가임 연령 커플의 약 8~12%에 영향을 미치며, 이는 1억 8,600만 명 이상에 해당합니다.

약 20%의 부부는 일상적인 진단 검사 후에도 불임의 원인을 확인할 수 없습니다. 특발성 불임의 원인 중 하나는 착상 과정의 장애일 수 있습니다.

착상은 배반포가 착상할 수 있는 능력이 자궁내막 수용성(자궁내막 수용성)과 겹치는 월경 주기의 특정 시점에 발생할 수 있습니다.

자궁내막이 이러한 특성을 나타내는 시간 간격을 이식 창이라고 합니다.

인간의 착상 기간은 3~6일의 기간이며 분비기의 절반, 즉 LH 정점 후 6~10일에 떨어집니다.

자궁내막에 의한 수용성의 획득은 세포 및 구조적 변화에 반영됩니다.

이 과정은 난소 기원의 에스트로겐과 프로게스테론에 의해 호르몬으로 조절됩니다. 또한 autocrine, paracrine 및 juxtacrine 신호 전달을 통해 사이토 카인, 성장 인자 및 지질 매개체와 같은 로컬 생성 신호 분자가 중요합니다.

유전적으로 수용적이고 결정적인 것은 Hoxa10 및 Hoxa11 호메오박스 유전자에 의해 구동되며, 그의 발현은 스테로이드 호르몬의 작용에 의해 증가됩니다. 자궁내막 내 세포 및 분자 수준의 변화는 상처 치유 및 암 침범 과정에서 매트릭스의 분해와 같은 과정과 비교됩니다.

자궁내막에 침투하는 면역계의 세포 중에서 대식세포, 림프구 및 NK 세포와 같은 단핵 세포가 우세합니다.

생식력에서 국소 염증의 역할을 고려할 때 중등도 또는 저강도의 급성 염증과 만성 염증을 구별하는 것이 필수적입니다.

염증 반응의 급성기에는 면역 체계의 세포가 사이토카인, 케모카인 및 급성기 단백질과 같은 용해성 매개체에 의해 촉진되는 주의 깊게 계획된 순서대로 손상 부위로 이동합니다. 부상의 정도에 따라 이 급성기는 손상을 복구하고 치유 과정을 시작하기에 충분할 수 있습니다.

자극에 장기간 노출되거나 자신의 조직에 대한 부적절한 반응의 결과로 염증이 지속되면 조직 손상과 섬유화가 발생할 수 있는 만성 단계로 이어질 수 있습니다.

주어진 염증에서 보이는 분자의 프로필은 염증 과정과 관련된 심각도, 기간 및 메커니즘은 물론 신체의 면역 체계가 반응하고 적응하는 능력에 따라 달라집니다.

이 연구의 목적은 선별된 염증 분자인 인터루킨18과 히스타민의 수준이 불임이 확인되지 않은 여성 인구에서 자연 임신한 자손을 가진 여성과 다른지 여부를 조사하는 것이었습니다.

재료 및 방법 전향적 단면 연구가 수행되었습니다. 연구 설계는 2017년 6월 29일자 Jagiellonian University No. 1072.6120.78.2017의 생명 윤리 위원회로부터 긍정적인 의견을 받았습니다. 자금은 과학 고등 교육부의 보조금 No. K/DSC/00421에서 얻었습니다. 연구 그룹은 원발성 불임 진단을 받은 58명의 여성으로 구성되었고 대조군은 자연 임신한 자손을 가진 8명의 환자로 구성되었습니다. 환자는 2017년 11월부터 2020년 3월까지 기간 동안 부인과 내분비과 및 부인과 클리닉에 입원하여 부인과 내분비 클리닉에서 상담하고 종합 생식 건강 프로그램에 따라 진단을 받은 여성 중에서 모집되었습니다.

연구 그룹의 포함 기준은 호르몬 요법을 사용하지 않고 정기적으로 월경을 하는 원발성 불임(1년 이상 임신 시도에 실패)을 앓고 있는 가임 연령(18-40세)의 여성이 충족했습니다.

배제 기준은 다음과 같습니다: 확립된 남성 불임 요인, 난관 요인, 자궁내막증, 골반 부위의 염증 - 현재 및 과거, 불임의 호르몬 배경, 비만, 인슐린 저항성, 적어도 1회 유산 후 상태 및 만성 자가면역 질환.

대조군의 포함 기준은 규칙적인 월경을 하는 3세 이하의 자연 임신 자손을 가진 가임 연령(18-40세)의 환자에 의해 충족되었습니다. 제외 기준은 다음과 같습니다: 자궁강 소파술, 자궁내막증, 골반 염증을 포함하는 자궁 수술 후 상태 - 현재 및 병력, 적어도 1회의 유산, 비만, 인슐린 저항성, 만성 자가면역 질환, 모유 수유.

연구를 위해 모집된 두 그룹의 환자는 이식 기간 동안 검사를 받았습니다. 주기의 적절한 타이밍은 초음파 배란 모니터링에 의해 결정되었습니다. 환자들은 우성 난포의 성장을 관찰하기 위해 주기의 10일 쯤에 보고했습니다. 3-4일 후에 검사를 반복하였다. 우세한 난포 성장이 확인되면 환자는 예상되는 월경 시작 16일 전에 집에서 소변 LH 검사를 시행했습니다. 환자들은 LH 피크 후 6-8일 또는 의심스러운 검사 결과의 경우 보고된 월경 주기 길이에 따라 결정되는 황체기 중간에 보고했습니다. 예상 기간의 8-4일 전입니다. 방문하는 동안 과거 배란을 확인하기 위해 초음파 검사를 수행했습니다(동일한 난소, 자궁내막 폭이 최소 10mm인 자궁내막에서 황체 관찰).

연구 문서에서 확인된 연구가 수행된 주기에서 성교를 포기할 필요성에 대해 환자에게 정보를 제공했습니다. 이 요구 사항을 수락하지 않은 환자는 연구에 참여할 수 없습니다. 내원 시 배란이 확인된 후 직경 약 0.5mm의 플라스틱 피펫을 이용하여 자궁내막 흡인 생검을 시행하였다. 3mm(피펠 자궁내막 흡인 큐렛). 피펫으로 자궁경관을 관통하는 데 어려움이 있는 경우 자궁경부의 윗입술을 클램프로 잡습니다. 환자에게 심한 통증이 있거나 자궁경관을 통과할 수 없는 경우에는 재료 수집을 중단했습니다. 검사 직후, 환자는 NRS(Numerical Rating Scale)에서 절차 중 통증의 강도를 수치로 평가하도록 요청받았습니다. 여기서 0은 전혀 통증이 없으며 10은 상상할 수 있는 가장 심한 통증입니다. 모든 환자에서 합병증은 없었다. 수집된 자궁내막 시료는 실온에서 10% 중성 완충 포르말린 용액에 보존한 후 CMUJ 임상 및 실험 병리과로 옮겨 파라핀 블록에 고정하였다.

같은 날, EDTA 상의 5ml 정맥혈 샘플을 각 환자로부터 채취했습니다. 혈액은 3000rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 혈청을 IL-18과 히스타민 수치 측정을 위해 Jagiellonian University Medical College의 임상생화학과로 보냈다.

면역조직화학 조직 물질을 포름알데히드에 24시간 동안 고정시켰다. 그런 다음 70% 에탄올 용액에서 탈수한 다음 파라핀에 포매했습니다. 조직을 4 µm 두께로 절단하여 실란화된 슬라이드에 장착했습니다. 섹션을 3개의 동일한 세트로 나누었습니다. 파라핀 제제를 탈랍(상온에서 3회 크실렌 교환; 첫 번째 교환 - 10분, 두 번째 및 세 번째 교환은 15분 후) 및 재수화(실온에서 3회 알코올 교환, 각각 5분). 그런 다음 준비물을 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 내인성 과산화효소를 차단하기 위해 3% H2O2 용액에서. 슬라이드를 증류수로 헹구고 TBS와 함께 5분 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 97 ° C의 수조에서 구연산 완충액 pH 6.0으로 마스크 해제했습니다. 준비물을 가리지 않은 후 Ultra Vision Protein Block 준비물(Thermo Scientific)을 5분 동안 적용했습니다. 습한 챔버의 실온에서. 그런 다음 적절한 항체를 적용하고 지정된 시간 동안 실온의 습한 챔버에서 배양했습니다(표 1). 섹션의 첫 번째 세트는 IL-18 반응성 토끼 다클론 항체(Recombinant IL18(Tyr37 ~ Asp193), Cloud-Clone Corp., 0.33 mg/ml Cat. PAA064HU01) 60분 동안 1:00 희석. 두 번째 세트는 히스타민 반응성 토끼 다클론 항체(Recombinant human histamine (Met1 ~ Ile163), Cloud-Clone Corp., 0.35mg/ml, catalog no. PAA927Ge01) 1:100 희석에서 30분. 세 번째 세트는 토끼 다클론 항체(Recombinant human GLUT4 (Met1 ~ Ile163) Cloud-Clone Corp., catalog no. PAC023HU01) 1:50 희석에서 30분 동안. 과량의 항체를 TBS 완충액으로 세척하고 Bright Vision plus(BrightVision + Goat anti-mouse/rabbit HRP - ImmunoLogic kit)에 대한 Post 항체 차단을 적용했습니다. 실온의 습한 챔버에서 20분 동안 배양합니다.

과량의 시약을 TBS 버퍼로 씻어내고 poly-HRP-GAMs/Rb IgG 제제(BrightVision + Goat 항-마우스/토끼 HRP - ImmunoLogic 키트)를 적용했습니다. 실온의 습한 챔버에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 과량의 시약을 TBS 버퍼로 씻어내고 DAB Quanto(Thermo Scientific)를 적용했습니다. 실온의 습한 챔버에서 약 5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 과량의 시약을 증류수로 헹구고 슬라이드를 hematoxylin(Thermo Scientific)으로 착색했습니다. 알코올과 자일렌의 농도를 증가시키면서 일련의 3가지 변화를 수행하여 제제를 탈수시켰다. 커버슬립(ThermoScientific의 CYTOSEAL)으로 닫습니다. 각 사이토카인의 발현은 이미지 분석기를 사용하여 계산된 분석된 샘플에서 평방 밀리미터당 양성 세포의 수로서 반정량적으로 평가되었습니다.

혈액 내 IL-18 및 히스타민 IL-18 측정은 인간 재조합 IL-18(Human IL-18 ELISA Kit, Biorbyt, catalog no. Orb50153). 혈액 샘플과 시약을 37 °C로 데운 다음 완전하고 균일하게 혼합하여 50 μL의 완충액을 사용하여 희석제로 1:2로 희석했습니다. 용액을 웰당 0.1ml씩 분배하였다. 웰이 있는 마이크로리터 플레이트를 뚜껑으로 덮고 37℃에서 90분 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 건조시키고, 비오티닐화 항인간 IL-18 항체 용액 0.1 ml를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 0.01M TBS(TRIS 완충 식염수)에서 3회 세척하고 매번 세척 완충액을 웰에 1분 동안 두었습니다. 완충액을 제거하고 플레이트를 건조시킨 후 준비된 avidin-biotin-peroxidase(ABC) 용액 0.1ml를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 0.01M TBS로 5회 헹구고 세척 완충액을 매번 1-2분 동안 웰에 두었습니다. 완충액을 제거하고 플레이트를 건조시킨 후, 각 웰에 90 ㎕의 TMB 염료를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 0.1ml의 TMB 대조 염료 용액을 각 웰에 첨가하고 즉시 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈청 히스타민 수치는 Histamin ELISA Immundiagnostik 시약(카탈로그 번호 K 8212)을 사용하여 ELISA로 측정했습니다. 세척 완충액 농축액(WASHBUF B)을 순수에 1:10으로 희석했습니다. 시약을 실온에 두었습니다. 혈장 샘플을 유도체화 시약과 혼합했습니다. 이어서 유도체화된 샘플을 실온에서 1시간 동안 히스타민 유도체 코팅된 ELISA 플레이트 상의 과산화효소 표지된 폴리클로날 히스타민 항체와 함께 수평 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 그런 다음 웰의 내용물을 세척 완충액 250μl로 5회 세척했습니다. 마지막 단계 후 잔여 완충액을 티슈 페이퍼로 제거했습니다. 그런 다음 100 μl의 기질(SUB)을 각 웰에 피펫팅하고 빛으로부터 보호된 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 조영제 용액 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 흡광도는 450 nm에서 즉시 측정되었습니다. 결과는 밀리리터당 피코그램으로 표시됩니다.

통계 분석. 통계 분석은 Statistica 프로그램(StatSoft 13.3)을 이용하여 수행하였다. 조사된 변수의 Shapiro-Wilk 정규성 검정과 제시된 빈도 차트는 변수의 분포가 정규적이지 않음을 보여주었다. 비모수 Wald-Wolfowitz 및 U Mann-Whitney 테스트를 사용하여 연구 그룹과 대조군을 비교했습니다. 상관 계수의 유의성 검정은 스튜던트 t-분포에 대한 통계를 기반으로 했습니다.