次亜塩素酸マウスウォッシュ、口腔細菌、黄色ブドウ球菌

最後に、本研究に採用された 83 人がいた。 歯周病専門医によって診断された歯周病患者53人を無作為にマウスウォッシュのみのグループ（26人）またはマウスウォッシュと歯周フロスナーのグループ（27人）に分けました。 本研究に採用された 30 人の対照があった。 口腔内細菌数を測定するために、リアルタイム ポリメラーゼ連鎖反応と連続希釈した黄色ブドウ球菌の純粋株を適用して、唾液中の口腔内細菌数を推定するための標準化された増殖曲線を作成しました。 介入の前に、参加者は5mlの水ですすぎ、口の中の食べ物の残骸やその他の残留物を枯渇させるように求められました. 介入は、参加者に 15 ml のうがい薬または水を口腔内で 5 分間すすぐように求められました。

参加者は、健康歴と歯のクリーニングツールの使用について尋ねられました。 参加者は関連する口腔健康検査を受け、口腔健康指数も記録されました。 本研究の介入に使用されたマウスウォッシュは、15 mL の市販の La Chlogen マウスウォッシュ (中華民国特許番号 M616466) で、5 分間使用されました。 うがい薬の主成分は低濃度高純度HOCl(100ppm)。 HOCl ソリューションは、La Chlogen 歯周フロッサ (中華民国特許番号 M590033) と組み合わせて使用​​することもできます。 コントロールは純水（１５ｍｌ）で５分間うがいをするように指示された。 各参加者は最初にプレテストを受け、参加者の唾液サンプルが採取された後、総口腔細菌数 (TOBC) が測定されました。 その後、各参加者は、唾を吐かずに、割り当てられた液体（うがい薬、うがい薬と歯周フロスまたは水）で口をすすぎました。 5分後、参加者は液体を吐き出し、これらの唾液サンプルを収集してテストし、TOBCを決定しました.

各参加者は、事前テストと事後テストの 2 つの唾液サンプル収集セッションを受けました。 唾液収集の前に、参加者は 5 ml の水ですすがれました。 この後、参加者は、刺激されていない全唾液を収集するために、最大 3 分間にわたって 50 ml の無菌遠心管 (Creative Biotechnology Co., Ltd.、台湾) に吐き出すように求められました。 収集された標本は、すぐに保管用のポータブル アイス ボックスに入れられ、同じ日に細菌 DNA 抽出のために実験室に戻されました。 細菌ゲノム DNA 抽出プロセスの前に、各サンプルの唾液量と重量も記録しました。

TOBC 分析: 細菌ゲノム DNA の抽出後、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) 技術を使用して、唾液サンプル中の口腔細菌の総数を定量化しました。 唾液サンプルを 2500 rpm で 5 分間遠心分離しました。 ペレットを300μlのリゾチーム溶液(2.5mg/mL)で懸濁した。 均一に混合した後、混合物を1.5mLエッペンドルフチューブに移し、氷上に1時間置いた。 その後、10% SDS (20μL)、0.5M EDTA (80μL)、および 20mg/mL プロテイナーゼ K (10μL) を各チューブに順番に加えました。各チューブの内容物を均一に混合し、55℃のオーブンに一晩入れました。 次に、１０Ｍ ＮＨ ４ ＯＡＣを等量で混合物に添加した。 混合物を氷上に５分間置き、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 得られた上清を 1.5 mL 遠沈管に入れました。 得られた混合物に等量のイソプロパノールを加え、混合物を-20℃で一晩、または-80℃で1時間保存した。 １３，０００ｒｐｍで１０分間遠心後、沈殿から上清を除き、７５％アルコール（５００μＬ）を加えて５分間静置し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。 その後、アルコールを除去した。 次に、100% アルコール (500 μL) をペレットに添加しました。 混合物を５分間放置し、続いて１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。 最後に、チューブ内のアルコールを注ぎ出し、遠心チューブを逆さにして残りのアルコールを蒸発させました。 最後に、DNA沈殿物を適量の滅菌水を使用して溶解し、55℃のオーブンに5分間入れ、-20℃で保存しました。 通常、OD260/OD280 比が 1.4 以上の DNA 検体。 回収された DNA の濃度は、OD260 = 1.00 での 50 μg/mL の濃度に基づいて計算され、DNA 定量後の各サンプルの TOBC を推定するのに適していると判断されました。 黄色ブドウ球菌 (ATCC 29213) は、細菌増殖曲線の推定における参照株として使用されました。 一晩培養した後、細菌溶液を5倍に段階希釈して、異なる濃度の黄色ブドウ球菌を含む標本を生成しました。 各検体を合計 10 μL 採取し、濃度が 2.5 × 103 ～ 3.9 × 107 CFU/mL になるように寒天培地にまきました。 細菌 DNA 抽出のために、それぞれ異なる細菌濃度の 1 mL の容量を採取しました。 抽出した細菌のゲノム DNA は、RT-PCR 試験を実施するまで -80°C で凍結保存しました。 RT-PCR テストの前に、細菌のゲノム DNA 濃度を測定しました。 RT-PCR テストは主に 16S rRNA を検出し、StepOnePlus システム (Applied Biosystems、Foster City、CA、USA) を使用して黄色ブドウ球菌濃度の標準曲線を確立しました。 使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの配列は、それぞれ 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' と 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3' でした.16 一般的な細菌種に対する選択されたフォワードおよびリバース プライマー ペアのカバー率は、それぞれ 94.9% および 92.8% です.16 総 PCR 量は 25 uL で、5.5 μL の ddH2O、1.0 μL の 5 μM プレプライマー、1.0 μL の 5 μM リバース プライマー、12.5 μL の SYBR 溶液、および 5.0 μL (0.25 μg) の DNA を含みます。 RT-PCRの反応条件は次のとおりです。94℃で10分間。その後、95℃で 45 秒、58℃で 40 秒、72℃で 60 秒を 35 サイクル。その後、72°C で 7 分間のサイクルを 1 サイクル行います。 標準曲線と RT-PCR の結果から得られた回帰式を使用して、各唾液サンプル中の細菌濃度を計算しました。 RT-PCR アッセイは、各サンプルについて 2 回繰り返し、閾値の変動係数は 2% から 12% の間で変化させました。 陰性対照群としてヒト血液DNAを使用した。

マウスウォッシュ液の抗菌力：標準菌株として用いた純粋培養黄色ブドウ球菌を、1.5%(g/L)ルリアブロス寒天を含む培養プレート(直径10cm)にまき、一晩培養した。 単一のコロニーを選択し、LB 栄養液の入った三角フラスコに入れ、振盪して一晩再培養し、得られた溶液を段階希釈してプレートにコーティングし、単位体積あたりの細菌数を計算しました。 最後に、Cell Counting Kit 8 (CCK-8、Engreen Biosystem) の市販試薬を使用して、マウスウォッシュの抗菌効果を評価しました。 各実験は重複して実行されました。 黄色ブドウ球菌の異なるコロニー形成単位 (0、10、100、1000、10000、100000、および 1000000) を含む溶液を 2000 rpm で 5 分間遠心分離して、細菌を濃縮しました。液体を除去した後、180 μL の新鮮な培養液を加えて、細菌を培養液に懸濁しました。 細菌溶液を96ウェルプレートに移した。 うがい薬の抗菌効果を評価するために、20 μL のうがい薬を細菌溶液の混合物に加えました。 混合物を３７℃で２時間インキュベートした。 最後に、10 μL の CCK-8 試薬を加え、よく混合しました。 得られた混合物を３７℃で２時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。 混合物中の細菌の数と細菌の生存率を推定するための標準成長曲線を確立し、それらを標準曲線と比較しました。

統計分析: データの収集とチェックが完了した後、最終的なデバッグ ファイルは、統計分析用の統計ソフトウェアを備えたコンピューターに転送されました。 使用された記述統計量には、度数分布表、パーセンテージ、平均、および標準偏差が含まれていました。 TOBC 分析では、記述統計量に加えて、t 検定、カイ 2 乗検定、および線形回帰分析を実施して、介入期間後の参加者の唾液中の細菌数の変化を評価および比較しました。 小さなサンプルサイズとTOBCの分布を考慮して、分析にはノンパラメトリック統計手法が使用されました。 ウィルコクソンの順位和検定を使用して、介入群と​​対照群の数値データの違いを特定し、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用して、ベースラインと介入後の数値データの変化を特定しました。 Wallis 検定と post hoc Tukey 検定を使用して、3 つ以上のグループの数値データの違いを特定しました。