Bain de bouche à l'acide hypochloreux, bactéries buccales et staphylocoque doré

Enfin, 83 personnes ont été recrutées pour la présente étude. Un total de 53 patients atteints d'une maladie parodontale diagnostiquée par un parodontiste, qui ont été assignés au hasard au groupe rince-bouche seul (26 patients) ou au groupe rince-bouche plus soie dentaire parodontale (27 patients). Il y avait 30 contrôles recrutés dans la présente étude. Pour la détermination du nombre de bactéries orales, une réaction en chaîne par polymérase en temps réel et une souche pure de Staphylococcus aureus avec des dilutions en série ont été appliquées pour créer une courbe de croissance standardisée pour l'estimation du nombre de bactéries orales dans la salive. Avant l'intervention, il était demandé aux participants de rincer 5 ml d'eau pour épuiser les débris alimentaires et les autres résidus en bouche. L'intervention a demandé aux participants de rincer le rince-bouche de 15 ml ou de l'eau pendant 5 minutes dans la cavité buccale.

On a demandé aux participants leurs antécédents médicaux et l'utilisation d'outils de nettoyage dentaire. Les participants ont subi des examens de santé bucco-dentaire pertinents et leurs indices de santé bucco-dentaire ont également été enregistrés. Le rince-bouche utilisé pour l'intervention dans la présente étude était les 15 mL de rince-bouche La Chlogen disponible dans le commerce (brevet de la République de Chine n° M616466) pour 5 minites. L'ingrédient principal du rince-bouche est le HOCl de haute pureté à faible concentration (100 ppm). Les solutions HOCl peuvent également être utilisées en conjonction avec le fil dentaire parodontal La Chlogen (brevet de la République de Chine n° M590033). Les témoins ont reçu pour instruction de se gargariser avec de l'eau pure (15 ml) pendant 5 minutes. Chaque participant a d'abord subi un prétest, dans lequel après que les échantillons de salive des participants ont été collectés, leur nombre total de bactéries orales (TOBC) a été mesuré. Par la suite, chaque participant s'est rincé la bouche avec le liquide qui lui avait été assigné (rince-bouche, rince-bouche plus soie dentaire parodontale ou eau) sans cracher. Après 5 minutes, les participants ont recraché le liquide, et ces échantillons de salive ont été collectés et testés pour déterminer le TOBC.

Chaque participant a subi deux séances de prélèvement d'échantillons de salive : prétest et posttest. Avant la collecte de salive, le participant a rincé avec 5 ml d'eau. Après cela, les participants ont été invités à expectorer sur une période maximale de 3 minutes dans un tube de centrifugation stérile de 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) pour la collecte de la salive entière non stimulée. Le spécimen collecté a ensuite été immédiatement placé dans une glacière portable pour stockage, renvoyé au laboratoire pour l'extraction de l'ADN bactérien le jour même. Le volume et le poids de la salive de chaque échantillon ont également été enregistrés avant le processus d'extraction de l'ADN génomique bactérien.

Analyse TOBC : Après l'extraction de l'ADN génomique bactérien, les techniques de réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) ont été utilisées pour quantifier le nombre total de bactéries buccales dans les échantillons de salive. L'échantillon de salive a été centrifugé à 2500 rpm pendant 5 minutes. Le culot a été mis en suspension avec 300 pl de solution de lysozyme (2,5 mg/ml). Après avoir été mélangé uniformément, le mélange a été transféré dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et placé sur de la glace pendant 1 heure. Ensuite, 10 % de SDS (20 µL), 0,5 M d'EDTA (80 µL) et 20 mg/mL de protéinase K (10 µL) ont été ajoutés à chaque tube dans l'ordre ; le contenu de chaque tube a été mélangé uniformément et placé dans une étuve à 55°C pendant une nuit. Ensuite, NH4OAC 10M a été ajouté au mélange en volume égal. Le mélange a été placé sur de la glace pendant 5 minutes et centrifugé à 13 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant résultant a été placé dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. De l'isopropanol a été ajouté au mélange résultant en un volume égal, et le mélange a été stocké à -20°C pendant une nuit ou à -80°C pendant 1 heure. Après centrifugation pendant 10 minutes à 13 000 tr/min, les surnageants ont été retirés des précipités, de l'alcool à 75 % (500 µL) a été ajouté et laissé au repos pendant 5 minutes, et le mélange a été centrifugé pendant 10 minutes à 13 000 tr/min. L'alcool a ensuite été éliminé. Ensuite, de l'alcool à 100 % (500 µL) a été ajouté au culot. Le mélange a été laissé au repos pendant 5 minutes puis centrifugé pendant 10 minutes à 13 000 tr/min. Enfin, l'alcool dans le tube a été versé et le tube de centrifugation a été placé à l'envers pour permettre à tout alcool restant de s'évaporer. Enfin, les précipités d'ADN ont été dissous en utilisant une quantité appropriée d'eau stérilisée, placés dans un four à 55°C pendant 5 minutes et stockés à -20°C. Généralement, les échantillons d'ADN avec un rapport OD260/OD280 de 1,4 ou plus. La concentration d'ADN récupéré a été calculée sur la base d'une concentration de 50 µg/mL à OD260 = 1,00, qui a été déterminée comme étant appropriée pour estimer le TOBC de chaque échantillon après la quantification de l'ADN. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) a été utilisé comme souche de référence dans l'estimation de la courbe de croissance bactérienne. Après une nuit de culture, la solution bactérienne a été diluée en série cinq fois pour générer des échantillons avec différentes concentrations de S. aureus. Un total de 10 µL de chacun des échantillons ont été prélevés et étalés sur le milieu gélosé pour atteindre des concentrations de 2,5 × 103 à 3,9 × 107 UFC/mL. Un volume de 1 ml de chaque concentration bactérienne différente a été prélevé pour l'extraction de l'ADN bactérien. L'ADN génomique bactérien extrait a été stocké congelé à -80°C jusqu'à ce que le test RT-PCR soit effectué. Avant le test RT-PCR, la concentration d'ADN génomique bactérien a été mesurée. Les tests RT-PCR détectent principalement l'ARNr 16S, et un système StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) a été utilisé pour établir une courbe standard de concentration de S. aureus. Les séquences de l'amorce sens et de l'amorce antisens utilisées étaient 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' et 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3', respectivement.16 Les taux de couverture des paires d'amorces sens et antisens sélectionnées pour les espèces bactériennes courantes sont respectivement de 94,9 % et 92,8 %.16 Le volume PCR total était de 25 µL, comprenant 5,5 µL de ddH2O, 1,0 µL de pré-amorce 5 µM, 1,0 µL d'amorce inverse 5 µM, 12,5 µL de solution SYBR et 5,0 µL (0,25 µg) d'ADN. Les conditions de réaction de RT-PCR étaient les suivantes : 94°C pendant 10 minutes ; suivi de 35 cycles de 95°C pendant 45 secondes, 58°C pendant 40 secondes et 72°C pendant 60 secondes ; et suivi d'un cycle de 72°C pendant 7 minutes. Une équation de régression dérivée de la courbe standard et des résultats de la RT-PCR a été utilisée pour calculer la concentration bactérienne dans chaque échantillon de salive. Le test RT-PCR a été réalisé en deux doubles pour chaque échantillon, et le coefficient de variation du seuil a été varié entre 2% et 12%. L'ADN sanguin humain a été utilisé comme groupe témoin négatif.

Activité antibactérienne de la solution de bain de bouche : le S. aureus de culture pure utilisé comme souche standard a été étalé sur une plaque de culture (10 cm de diamètre) contenant 1,5 % (g/L) de gélose au bouillon de luria et cultivé pendant une nuit. Une seule colonie a été sélectionnée et placée dans une fiole conique contenant du liquide nutritif LB, secouée et remise en culture pendant la nuit, et la solution résultante a été diluée en série et enduite sur la plaque pour calculer le nombre de bactéries par unité de volume. Enfin, un réactif commercial Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) a été utilisé pour évaluer l'effet antibactérien du bain de bouche. Chaque expérience a été réalisée en double. Des solutions contenant différentes unités formant colonies (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 et 1000000) de S. aureus ont été centrifugées à 2000 tr/min pendant 5 minutes pour concentrer les bactéries ; après le retrait du liquide, 180 µL de milieu de culture frais ont été ajoutés pour suspendre les bactéries dans le milieu de culture. La solution de bactéries a été transférée dans une plaque à 96 puits. Pour évaluer l'effet antibactérien du rince-bouche, 20 µL du rince-bouche ont été ajoutés au mélange de la solution bactérienne. Le mélange a été incubé à 37°C pendant 2 heures. Enfin, 10 µL de réactif CCK-8 ont été ajoutés et bien mélangés. Le mélange résultant a été incubé à 37°C pendant 2 heures, et l'absorbance à 450 nm a été mesurée en utilisant un lecteur ELISA. La courbe de croissance standard a pu être établie pour l'estimation du nombre de bactéries dans le mélange et leur taux de survie des bactéries, qui ont ensuite été comparées à la courbe standard.

Analyse statistique : Une fois la collecte et la vérification des données terminées, les fichiers débogués finalisés ont été transférés sur un ordinateur avec un logiciel statistique pour l'analyse statistique. Les statistiques descriptives utilisées comprenaient des tableaux de distribution de fréquence, des pourcentages, des moyennes et des écarts-types. Dans l'analyse TOBC, en plus des statistiques descriptives, un test t, un test du chi carré et une analyse de régression linéaire ont été effectués pour évaluer et comparer les changements dans le nombre de bactéries dans la salive des participants après la période d'intervention. Compte tenu de la petite taille de l'échantillon et de la distribution de TOBC, des méthodes statistiques non paramétriques ont été utilisées pour l'analyse. Le test de somme des rangs de Wilcoxon a été utilisé pour identifier les différences dans les données numériques du groupe d'intervention et du groupe témoin, le test des rangs signés de Wilcoxon a été utilisé pour identifier les changements dans les données numériques entre la ligne de base et la post-intervention, et le test de Kruskal- Le test de Wallis et un test post hoc de Tukey ont été utilisés pour identifier les différences dans les données numériques de trois groupes ou plus.