Enjuague bucal con ácido hipocloroso, bacterias orales y Staphylococcus Aureus

Finalmente hubo 83 personas reclutadas en el presente estudio. Un total de 53 pacientes con enfermedad periodontal diagnosticada por un periodoncista, que fueron asignados aleatoriamente al grupo de solo enjuague bucal (26 pacientes) o al grupo de enjuague bucal más hilo dental periodontal (27 pacientes). Hubo 30 controles reclutados en el presente estudio. Para la determinación de los recuentos de bacterias orales, se aplicó una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real y una cepa pura de Staphylococcus aureus con diluciones en serie para crear una curva de crecimiento estandarizada para la estimación de los recuentos de bacterias orales en la saliva. Antes de la intervención, se pidió a los participantes que se enjuagaran 5 ml de agua para eliminar los restos de comida y otros residuos en la boca. En la intervención se pidió a los participantes que se enjuagaran los 15 ml de enjuague bucal o agua durante 5 minutos en la cavidad bucal.

Se preguntó a los participantes su historial de salud y el uso de herramientas de limpieza dental. Los participantes se sometieron a los exámenes de salud bucal pertinentes y también se registraron sus índices de salud bucal. El enjuague bucal utilizado para la intervención en el presente estudio fue el enjuague bucal La Chlogen de 15 ml disponible comercialmente (República de China Patente No. M616466) durante 5 minutos. El ingrediente principal del enjuague bucal es HOCl de baja concentración y alta pureza (100 ppm). Las soluciones de HOCl también se pueden utilizar junto con el hilo dental periodontal La Chlogen (República de China Patente No. M590033). Se instruyó a los controles para que hicieran gárgaras con agua pura (15 ml) durante 5 minutos. Cada participante se sometió primero a una prueba previa, en la que, después de recolectar muestras de saliva de los participantes, se midió su recuento total de bacterias orales (TOBC). Posteriormente, cada participante se enjuagó la boca con el líquido asignado (enjuague bucal, colutorio más hilo dental o agua) sin escupir. Después de 5 minutos, los participantes escupieron el líquido y estas muestras de saliva se recolectaron y analizaron para determinar el TOBC.

Cada participante se sometió a dos sesiones de recolección de muestras de saliva: pretest y postest. Antes de la recolección de saliva, el participante se enjuagó con 5 ml de agua. Después de esto, se pidió a los participantes que expectoraran durante un período máximo de 3 minutos en un tubo de centrifugación estéril de 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwán) para la recolección de saliva completa no estimulada. La muestra recolectada se colocó inmediatamente en una hielera portátil para su almacenamiento y se devolvió al laboratorio para la extracción de ADN bacteriano el mismo día. El volumen de saliva y el peso de cada muestra también se registraron antes del proceso de extracción de ADN genómico bacteriano.

Análisis TOBC: Después de la extracción del ADN genómico bacteriano, se utilizaron técnicas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para cuantificar los recuentos totales de bacterias orales en las muestras de saliva. La muestra de saliva se centrifugó a 2500 rpm durante 5 minutos. El precipitado se suspendió con 300 µl de solución de lisozima (2,5 mg/ml). Después de mezclar uniformemente, la mezcla se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 ml y se colocó en hielo durante 1 hora. A continuación, se añadieron secuencialmente a cada tubo SDS al 10 % (20 µl), EDTA 0,5 M (80 µl) y 20 mg/ml de proteinasa K (10 µl); el contenido de cada tubo se mezcló uniformemente y se colocó en un horno a 55°C durante la noche. A continuación, se añadió NH4OAC 10 M a la mezcla en un volumen igual. La mezcla se colocó en hielo durante 5 minutos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se colocó en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Se añadió isopropanol a la mezcla resultante en un volumen igual y la mezcla se almacenó a -20°C durante la noche oa -80°C durante 1 hora. Después de centrifugar durante 10 minutos a 13.000 rpm, se eliminó el sobrenadante de los precipitados, se añadió alcohol al 75 % (500 µL) y se dejó reposar durante 5 minutos y la mezcla se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm. Luego se eliminó el alcohol. A continuación, se añadió al sedimento alcohol al 100 % (500 µl). La mezcla se dejó reposar durante 5 minutos y posteriormente se centrifugó durante 10 minutos a 13.000 rpm. Finalmente, se vertió el alcohol del tubo y se colocó el tubo de centrífuga boca abajo para permitir que se evaporara el alcohol restante. Finalmente, los precipitados de ADN se disolvieron usando una cantidad adecuada de agua esterilizada, se colocaron en un horno a 55 °C durante 5 minutos y se almacenaron a -20 °C. Generalmente, las muestras de ADN con una relación OD260/ OD280 de 1,4 o superior. La concentración de ADN recuperado se calculó sobre la base de una concentración de 50 µg/mL a OD260 = 1,00, que se determinó que era adecuada para estimar el TOBC de cada muestra después de la cuantificación del ADN. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) se utilizó como cepa de referencia en la estimación de la curva de crecimiento bacteriano. Después del cultivo durante la noche, la solución bacteriana se diluyó en serie cinco veces para generar muestras con diferentes concentraciones de S. aureus. Se tomaron un total de 10 µL de cada uno de los especímenes y se esparcieron sobre el medio agar para alcanzar concentraciones de 2,5 × 103 a 3,9 × 107 UFC/mL. Se tomó un volumen de 1 mL de cada concentración bacteriana diferente para la extracción de ADN bacteriano. El ADN genómico bacteriano extraído se almacenó congelado a -80 °C hasta que se realizó la prueba de RT-PCR. Antes de la prueba de RT-PCR, se midió la concentración de ADN genómico bacteriano. Las pruebas de RT-PCR detectan principalmente 16S rRNA, y se utilizó un sistema StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) para establecer una curva estándar de concentración de S. aureus. Las secuencias del cebador directo y del cebador inverso utilizadas fueron 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' y 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3', respectivamente.16 Las tasas de cobertura del par de cebadores directo e inverso seleccionados para especies bacterianas comunes son 94,9% y 92,8%, respectivamente.16 El volumen total de PCR fue de 25 uL, compuesto por 5,5 µL de ddH2O, 1,0 µL de precebador 5 µM, 1,0 µL de cebador inverso 5 µM, 12,5 µL de solución SYBR y 5,0 µL (0,25 µg) de ADN. Las condiciones de reacción de la RT-PCR fueron las siguientes: 94°C durante 10 minutos; seguido de 35 ciclos de 95°C durante 45 segundos, 58°C durante 40 segundos y 72°C durante 60 segundos; y seguido de un ciclo de 72°C durante 7 minutos. Se utilizó una ecuación de regresión derivada de la curva estándar y los resultados de la RT-PCR para calcular la concentración bacteriana en cada muestra de saliva. El ensayo de RT-PCR se realizó dos duplicados para cada muestra, y el coeficiente de variación del umbral se varió entre 2% y 12%. Se usó ADN de sangre humana como grupo de control negativo.

Actividad antibacteriana de la solución de enjuague bucal: el S. aureus de cultivo puro utilizado como cepa estándar se sembró en una placa de cultivo (10 cm de diámetro) que contenía 1,5 % (g/L) de agar caldo de luria y se cultivó durante la noche. Se seleccionó una sola colonia y se colocó en un matraz cónico que contenía líquido nutritivo LB, se agitó y se volvió a cultivar durante la noche, y la solución resultante se diluyó en serie y se recubrió en la placa para calcular el número de bacterias por unidad de volumen. Finalmente, se utilizó un reactivo comercial Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) para evaluar el efecto antibacteriano del enjuague bucal. Cada experimento se realizó por duplicado. Las soluciones que contenían diferentes unidades formadoras de colonias (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 y 1000000) de S. aureus se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos para concentrar las bacterias; después de retirar el líquido, se añadieron 180 µL de medio de cultivo fresco para suspender las bacterias en el medio de cultivo. La solución de bacterias se transfirió a una placa de 96 pocillos. Para evaluar el efecto antibacteriano del enjuague bucal, se agregaron 20 µL del enjuague bucal a la mezcla de la solución bacteriana. La mezcla se incubó a 37°C durante 2 horas. Finalmente, se agregaron 10 µL del reactivo CCK-8 y se mezcló bien. La mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 2 horas y se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector ELISA. La curva de crecimiento estándar se pudo establecer para la estimación del número de bacterias en la mezcla y su tasa de supervivencia de las bacterias, que luego se compararon con la curva estándar.

Análisis estadístico: después de completar la recopilación y verificación de datos, los archivos depurados finalizados se transfirieron a una computadora con software estadístico para el análisis estadístico. Las estadísticas descriptivas utilizadas incluyeron tablas de distribución de frecuencias, porcentajes, medias y desviaciones estándar. En el análisis TOBC, además de las estadísticas descriptivas, se realizaron una prueba t, una prueba de chi-cuadrado y un análisis de regresión lineal para evaluar y comparar los cambios en los recuentos bacterianos de la saliva de los participantes después del período de intervención. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño de la muestra y la distribución de TOBC, se utilizaron métodos estadísticos no paramétricos para el análisis. Se usó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para identificar diferencias en los datos numéricos del grupo de intervención y el grupo de control, la prueba de rangos con signo de Wilcoxon se usó para identificar cambios en los datos numéricos entre el inicio y la post-intervención, y la prueba de Kruskal- Se utilizaron la prueba de Wallis y una prueba post hoc de Tukey para identificar las diferencias en los datos numéricos de tres o más grupos.