Hypochlorsäure-Mundwasser, orale Bakterien und Staphylococcus Aureus

Schließlich wurden 83 Personen für die vorliegende Studie rekrutiert. Insgesamt 53 Patienten mit parodontaler Erkrankung, die von einem Parodontologen diagnostiziert wurden, wurden nach dem Zufallsprinzip der Gruppe mit nur Mundwasser (26 Patienten) oder der Gruppe mit Mundwasser plus Zahnseide (27 Patienten) zugeteilt. Es wurden 30 Kontrollpersonen in die vorliegende Studie rekrutiert. Zur Bestimmung der oralen Bakterienzahlen wurden eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und ein reiner Stamm von Staphylococcus aureus mit seriellen Verdünnungen angewendet, um eine standardisierte Wachstumskurve für die Schätzung der oralen Bakterienzahlen im Speichel zu erstellen. Vor der Intervention wurden die Teilnehmer gebeten, 5 ml Wasser auszuspülen, um die Speisereste und andere Rückstände im Mund zu entfernen. Bei der Intervention wurden die Teilnehmer gebeten, die 15 ml Mundwasser oder Wasser für 5 Minuten in der Mundhöhle zu spülen.

Die Teilnehmer wurden nach ihrer Gesundheitsgeschichte und der Verwendung von Zahnreinigungswerkzeugen gefragt. Die Teilnehmer wurden relevanten Mundgesundheitsuntersuchungen unterzogen, und ihre Mundgesundheitsindizes wurden ebenfalls erfasst. Das für die Intervention in der vorliegenden Studie verwendete Mundwasser war 15 ml des im Handel erhältlichen La Chlogen-Mundwassers (Patent Nr. M616466 der Republik China) für 5 Minuten. Der Hauptbestandteil des Mundwassers ist niedrig konzentriertes, hochreines HOCl (100 ppm). Die HOCl-Lösungen können auch in Verbindung mit der Parodontal-Zahnseide von La Chlogen (Patent Nr. M590033 der Republik China) verwendet werden. Die Kontrollen wurden angewiesen, 5 Minuten lang mit reinem Wasser (15 ml) zu gurgeln. Jeder Teilnehmer durchlief zunächst einen Vortest, bei dem nach der Entnahme der Speichelproben der Teilnehmer ihre gesamte orale Bakterienzahl (TOBC) gemessen wurde. Danach spülte jeder Teilnehmer seinen Mund mit der ihm zugewiesenen Flüssigkeit (Mundspülung, Mundspülung plus Zahnseide oder Wasser) ohne auszuspucken. Nach 5 Minuten spuckten die Teilnehmer die Flüssigkeit aus, und diese Speichelproben wurden gesammelt und getestet, um den TOBC zu bestimmen.

Jeder Teilnehmer unterzog sich zwei Sitzungen zur Speichelprobenentnahme: Pretest und Posttest. Vor der Speichelsammlung spülte der Teilnehmer mit 5 ml Wasser. Danach wurden die Teilnehmer gebeten, über einen Zeitraum von maximal 3 Minuten in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) zu spucken, um unstimulierten Gesamtspeichel zu sammeln. Die entnommene Probe wurde dann sofort zur Aufbewahrung in eine tragbare Eisbox gegeben und für die bakterielle DNA-Extraktion am selben Tag ins Labor zurückgebracht. Das Speichelvolumen und -gewicht jeder Probe wurde auch vor dem Extraktionsprozess der bakteriellen genomischen DNA aufgezeichnet.

TOBC-Analyse: Nach der Extraktion der bakteriellen genomischen DNA wurden die Techniken der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet, um die Gesamtzahl der oralen Bakterien in den Speichelproben zu quantifizieren. Die Speichelprobe wurde 5 Minuten bei 2500 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 300 &mgr;l Lysozymlösung (2,5 mg/ml) suspendiert. Nach gleichmäßigem Mischen wurde die Mischung in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und 1 Stunde auf Eis gestellt. Danach wurden 10 % SDS (20 &mgr;l), 0,5 M EDTA (80 &mgr;l) und 20 mg/ml Proteinase K (10 &mgr;l) nacheinander zu jedem Röhrchen gegeben; der Inhalt jedes Röhrchens wurde gleichmäßig gemischt und über Nacht in einen Ofen bei 55°C gestellt. Als nächstes wurde 10 M NH 4 OAC in gleichem Volumen zu der Mischung gegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten auf Eis gestellt und 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. Zu der resultierenden Mischung wurde Isopropanol in gleichem Volumen gegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei –20°C oder 1 Stunde bei –80°C gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 U/min wurden die Überstände von den Präzipitaten entfernt, 75 % Alkohol (500 ul) wurde zugegeben und 5 Minuten stehen gelassen, und die Mischung wurde 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der Alkohol wurde dann entfernt. Als nächstes wurde dem Pellet 100 % Alkohol (500 &mgr;l) zugesetzt. Die Mischung wurde 5 Minuten stehen gelassen und anschließend 10 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugiert. Schließlich wurde der Alkohol aus dem Röhrchen ausgegossen und das Zentrifugenröhrchen wurde auf den Kopf gestellt, um jeglichen verbleibenden Alkohol verdampfen zu lassen. Schließlich wurden die DNA-Präzipitate unter Verwendung einer geeigneten Menge an sterilisiertem Wasser gelöst, 5 Minuten lang in einen Ofen bei 55°C gegeben und bei –20°C gelagert. Im Allgemeinen die DNA-Proben mit einem OD260/OD280-Verhältnis von 1,4 oder höher. Die Konzentration der gewonnenen DNA wurde auf der Grundlage einer Konzentration von 50 µg/ml bei OD260 = 1,00 berechnet, die sich nach der DNA-Quantifizierung als geeignet für die Schätzung des TOBC jeder Probe herausstellte. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) wurde als Referenzstamm bei der Schätzung der Bakterienwachstumskurve verwendet. Nach der Kultivierung über Nacht wurde die Bakterienlösung fünfmal seriell verdünnt, um Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von S. aureus zu erzeugen. Insgesamt 10 µl jeder Probe wurden entnommen und auf dem Agarmedium verteilt, um Konzentrationen von 2,5 × 103 bis 3,9 × 107 KBE/ml zu erreichen. Ein Volumen von 1 ml jeder unterschiedlichen Bakterienkonzentration wurde für die bakterielle DNA-Extraktion entnommen. Die extrahierte bakterielle genomische DNA wurde gefroren bei –80°C gelagert, bis der RT-PCR-Test durchgeführt wurde. Vor dem RT-PCR-Test wurde die bakterielle genomische DNA-Konzentration gemessen. RT-PCR-Tests detektieren hauptsächlich 16S-rRNA, und ein StepOnePlus-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) wurde verwendet, um eine Standardkurve der S. aureus-Konzentration zu erstellen. Die Sequenz des verwendeten Vorwärtsprimers und Rückwärtsprimers war 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' bzw. 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 Die Abdeckungsraten ausgewählter Forward- und Reverse-Primerpaare für gängige Bakterienarten betragen 94,9 % bzw. 92,8 %.16 Das PCR-Gesamtvolumen betrug 25 µl und umfasste 5,5 µl ddH2O, 1,0 µl 5 µM Preprimer, 1,0 µL 5 µM Reverse Primer, 12,5 µL SYBR-Lösung und 5,0 µL (0,25 µg) DNA. Die RT-PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 94°C für 10 Minuten; gefolgt von 35 Zyklen von 95°C für 45 Sekunden, 58°C für 40 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden; und gefolgt von einem Zyklus von 72°C für 7 Minuten. Eine aus der Standardkurve und den RT-PCR-Ergebnissen abgeleitete Regressionsgleichung wurde verwendet, um die Bakterienkonzentration in jeder Speichelprobe zu berechnen. Der RT-PCR-Assay wurde mit zwei Duplikaten für jede Probe durchgeführt, und der Variationskoeffizient des Schwellenwerts wurde zwischen 2 % und 12 % variiert. Menschliche Blut-DNA wurde als negative Kontrollgruppe verwendet.

Antibakterielle Aktivität der Mundwasserlösung: Der als Standardstamm verwendete rein kultivierte S. aureus wurde auf eine Kulturplatte (10 cm Durchmesser) enthaltend 1,5 % (g/L) Luria Broth Agar ausplattiert und über Nacht kultiviert. Eine einzelne Kolonie wurde ausgewählt und in einen Erlenmeyerkolben gegeben, der LB-Nährflüssigkeit enthielt, geschüttelt und über Nacht rekultiviert, und die resultierende Lösung wurde seriell verdünnt und auf die Platte aufgetragen, um die Anzahl der Bakterien pro Volumeneinheit zu berechnen. Schließlich wurde ein kommerzielles Reagenz des Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) verwendet, um die antibakterielle Wirkung des Mundwassers zu bewerten. Jedes Experiment wurde doppelt durchgeführt. Lösungen, die verschiedene koloniebildende Einheiten (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 und 1000000) von S. aureus enthielten, wurden bei 2000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um die Bakterien zu konzentrieren; Nachdem die Flüssigkeit entfernt war, wurden 180 &mgr;l frisches Kulturmedium hinzugefügt, um die Bakterien im Kulturmedium zu suspendieren. Die Bakterienlösung wurde in eine Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Um die antibakterielle Wirkung des Mundwassers zu bewerten, wurden 20 &mgr;l des Mundwassers zu der Mischung der Bakterienlösung gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Schließlich wurden 10 &mgr;l CCK-8-Reagenz zugegeben und gut gemischt. Die resultierende Mischung wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und die Extinktion bei 450 nm wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts gemessen. Zur Abschätzung der Bakterienzahl in der Mischung und ihrer Überlebensrate der Bakterien konnte die Standardwachstumskurve erstellt werden, die dann mit der Standardkurve verglichen wurden.

Statistische Analyse: Nachdem die Datensammlung und -prüfung abgeschlossen waren, wurden die endgültigen, von Fehlern befreiten Dateien zur statistischen Analyse auf einen Computer mit Statistiksoftware übertragen. Die verwendeten deskriptiven Statistiken umfassten Häufigkeitsverteilungstabellen, Prozentsätze, Mittelwerte und Standardabweichungen. Bei der TOBC-Analyse wurden neben der deskriptiven Statistik ein t-Test, ein Chi-Quadrat-Test und eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt, um die Veränderungen der Keimzahlen im Speichel der Teilnehmer nach der Interventionsphase zu bewerten und zu vergleichen. In Anbetracht der geringen Stichprobengröße und der Verteilung von TOBC wurden nichtparametrische statistische Methoden zur Analyse verwendet. Der Wilcoxon-Rangsummentest wurde verwendet, um Unterschiede in den numerischen Daten der Interventionsgruppe und der Kontrollgruppe zu identifizieren, der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test wurde verwendet, um Änderungen in den numerischen Daten zwischen der Baseline und nach der Intervention zu identifizieren, und der Kruskal- Der Wallis-Test und ein Post-hoc-Tukey-Test wurden verwendet, um Unterschiede in den numerischen Daten von drei oder mehr Gruppen zu identifizieren.