Hypoklorsyre munnvann, orale bakterier og Staphylococcus Aureus

Til slutt ble det rekruttert 83 personer til denne studien. Totalt 53 pasienter med periodontal sykdom diagnostisert av en periodontist, som ble tilfeldig fordelt til gruppen med kun munnvann (26 pasienter) eller gruppen med munnvann pluss tanntråd (27 pasienter). Det var 30 kontroller rekruttert til denne studien. For å bestemme orale bakterietellinger ble en sanntids polymerasekjedereaksjon og en ren stamme av Staphylococcus aureus med seriefortynninger brukt for å lage en standardisert vekstkurve for estimering av orale bakterietellinger i spytt. Før intervensjonen ble deltakerne bedt om å skylle 5 ml vann for å tømme matrester og andre rester i munnen. Intervensjonen ble bedt deltakerne om å skylle 15 ml munnvann eller vann i 5 minutter i munnhulen.

Deltakerne ble spurt om deres helsehistorie og bruk av tannrenseverktøy. Deltakerne gjennomgikk relevante munnhelseundersøkelser, og deres munnhelseindekser ble også registrert. Munnvannet som ble brukt til intervensjon i denne studien var 15 ml kommersielt tilgjengelig La Chlogen munnvann (Republic of China Patent No. M616466) for 5 minites. Hovedingrediensen i munnvannet er lavkonsentrasjon og høy renhet HOCl (100 ppm). HOCl-løsningene kan også brukes sammen med La Chlogen periodontal flosser (Kina-patent nr. M590033). Kontrollene ble instruert til å gurgle med rent vann (15 ml) i 5 minutter. Hver deltaker gjennomgikk først en forhåndstest, der etter at deltakernes spyttprøver ble samlet inn, ble deres totale orale bakterietelling (TOBC) målt. Deretter skyllet hver deltaker munnen med den tildelte væsken (munnvann, munnvann pluss tanntråd eller vann) uten å spytte. Etter 5 minutter spyttet deltakerne ut væsken, og disse spyttprøvene ble samlet inn og testet for å bestemme TOBC.

Hver deltaker gjennomgikk to spyttprøvesamlinger: pretest og posttest. Før spyttoppsamlingen skyllet deltakeren med 5 ml vann. Etter dette ble deltakerne bedt om å ekspektorere over en maksimal periode på 3 minutter inn i et 50 ml sterilt sentrifugeringsrør (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) for oppsamling av ustimulert hel spytt. Den innsamlede prøven ble deretter umiddelbart plassert i en bærbar isboks for lagring, returnert til laboratoriet for samme dag bakteriell DNA-ekstraksjon. Spyttvolumet og vekten av hver prøve ble også registrert før den bakterielle genomiske DNA-ekstraksjonsprosessen.

TOBC-analyse: Etter ekstraksjonen av bakteriell genomisk DNA, ble sanntids polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)-teknikker brukt for å kvantifisere det totale antallet orale bakterier i spyttprøvene. Spyttprøven ble sentrifugert ved 2500 rpm i 5 minutter. Pelleten ble suspendert med 300 ul lysozymløsning (2,5 mg/ml). Etter å ha blitt blandet jevnt, ble blandingen overført til et 1,5 ml Eppendorf-rør og plassert på is i 1 time. Deretter ble 10 % SDS (20 µL), 0,5 M EDTA (80 µL) og 20 mg/ml proteinase K (10 µL) tilsatt til hvert rør i rekkefølge; innholdet i hvert rør ble blandet jevnt og plassert i en 55°C ovn over natten. Deretter ble 10M NH4OAC tilsatt til blandingen i likt volum. Blandingen ble plassert på is i 5 minutter og sentrifugert ved 13 000 rpm i 10 minutter. Den resulterende supernatanten ble plassert i et 1,5 ml sentrifugerør. Isopropanol ble tilsatt til den resulterende blanding i likt volum, og blandingen ble lagret ved -20°C over natten eller -80°C i 1 time. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 13 000 rpm ble supernatantene fjernet fra bunnfallene, 75 % alkohol (500 ul) ble tilsatt og fikk stå i 5 minutter, og blandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved 13 000 rpm. Alkoholen ble deretter fjernet. Deretter ble 100 % alkohol (500 ul) tilsatt til pelleten. Blandingen fikk stå i 5 minutter og deretter sentrifugert i 10 minutter ved 13 000 rpm. Til slutt ble alkoholen i røret helt ut, og sentrifugerøret ble plassert opp ned for å la eventuell gjenværende alkohol fordampe. Til slutt ble DNA-precipitatene oppløst ved bruk av en passende mengde sterilisert vann, plassert i en ovn ved 55°C i 5 minutter og lagret ved -20°C. Vanligvis har DNA-prøvene et OD260/OD280-forhold på 1,4 eller høyere. Konsentrasjonen av gjenvunnet DNA ble beregnet på grunnlag av en konsentrasjon på 50 µg/ml ved OD260 = 1,00, som ble bestemt å være egnet for å estimere TOBC for hver prøve etter DNA-kvantifiseringen. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) ble brukt som referansestamme ved estimering av bakterievekstkurve. Etter dyrking over natten ble bakterieoppløsningen seriefortynnet fem ganger for å generere prøver med forskjellige konsentrasjoner av S. aureus. Totalt 10 µL av hver av prøvene ble tatt og spredt på agarmediet for å oppnå konsentrasjoner på 2,5 × 103 til 3,9 × 107 CFU/ml. Et volum på 1 ml av hver forskjellig bakteriekonsentrasjon ble tatt for bakteriell DNA-ekstraksjon. Det ekstraherte bakterielle genomiske DNA ble lagret frosset ved -80°C inntil RT-PCR-testen ble utført. Før RT-PCR-testen ble den bakterielle genomiske DNA-konsentrasjonen målt. RT-PCR-tester påviser hovedsakelig 16S rRNA, og et StepOnePlus-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ble brukt for å etablere en standardkurve for S. aureus-konsentrasjon. Sekvensen til forover-primeren og revers-primeren som ble brukt var henholdsvis 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' og 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 Dekningsgraden for utvalgte frem- og bakover-primerpar for vanlige bakteriearter er henholdsvis 94,9 % og 92,8 %.16 Det totale PCR-volumet var 25 µL, omfattende 5,5 µL ddH2O, 1,0 µL 5-µM preprimer, 1,0 µL 5-µM revers primer, 12,5 µL SYBR-løsning og 5,0 µL 5-µl (0,2 µl) DNA. RT-PCR-reaksjonsbetingelsene var som følger: 94°C i 10 minutter; etterfulgt av 35 sykluser med 95°C i 45 sekunder, 58°C i 40 sekunder og 72°C i 60 sekunder; og etterfulgt av en syklus på 72°C i 7 minutter. En regresjonsligning avledet fra standardkurven og RT-PCR-resultatene ble brukt til å beregne bakteriekonsentrasjonen i hver spyttprøve. RT-PCR-analysen ble utført to duplikater for hver prøve, og variasjonskoeffisienten for terskelen ble variert mellom 2 % og 12 %. Menneskelig blod-DNA ble brukt som en negativ kontrollgruppe.

Antibakteriell aktivitet av munnskylleløsningen: Den rendyrkede S. aureus brukt som standardstammen ble sådd ut på en kulturplate (10 cm i diameter) inneholdende 1,5 % (g/l) luriabuljongagar og dyrket over natten. En enkelt koloni ble valgt og plassert i en konisk kolbe inneholdende LB-næringsvæske, ristet og gjenkulturert over natten, og den resulterende løsningen ble seriefortynnet og belagt på platen for å beregne antall bakterier per volumenhet. Til slutt ble et kommersielt reagens for celletellesett 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) brukt for å evaluere den antibakterielle effekten av munnvannet. Hvert eksperiment ble utført i duplikat. Løsninger inneholdende forskjellige kolonidannende enheter (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 og 1000000) av S. aureus ble sentrifugert ved 2000 rpm i 5 minutter for å konsentrere bakteriene; etter at væsken var fjernet, ble 180 µL ferskt kulturmedium tilsatt for å suspendere bakteriene i kulturmediet. Bakterieløsningen ble overført til en 96-brønners plate. For å evaluere den antibakterielle effekten av munnvannet ble 20 µL av munnvannet tilsatt blandingen av bakterieoppløsningen. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 timer. Til slutt ble 10 µL CCK-8-reagens tilsatt og blandet godt. Den resulterende blandingen ble inkubert ved 37°C i 2 timer, og absorbansen ved 450 nm ble målt ved bruk av en ELISA-leser. Standard vekstkurven kunne etableres for estimering av antall bakterier i blandingen og deres overlevelsesrate for bakteriene, som deretter ble sammenlignet med standardkurven.

Statistisk analyse: Etter at datainnsamlingen og kontrollen var fullført, ble de ferdige feilsøkte filene overført til en datamaskin med statistisk programvare for statistisk analyse. Den beskrivende statistikken som ble brukt inkluderte frekvensfordelingstabeller, prosenter, gjennomsnitt og standardavvik. I TOBC-analysen ble det i tillegg til beskrivende statistikk utført en t-test, kjikvadrattest og lineær regresjonsanalyse for å vurdere og sammenligne endringene i bakterietallet i deltakernes spytt etter intervensjonsperioden. Med tanke på den lille prøvestørrelsen og fordelingen av TOBC, ble ikke-parametriske statistiske metoder brukt for analyse. Wilcoxon rangsum-testen ble brukt til å identifisere forskjeller i de numeriske dataene til intervensjonsgruppen og kontrollgruppen, Wilcoxon signed-rank testen ble brukt til å identifisere endringer i numeriske data mellom baseline og post-intervensjon, og Kruskal- Wallis-test og en post hoc Tukey-test ble brukt for å identifisere forskjeller i numeriske data for tre eller flere grupper.