Mondwater met hypochloorzuur, orale bacteriën en Staphylococcus Aureus

Uiteindelijk werden er 83 personen gerekruteerd voor de huidige studie. Een totaal van 53 patiënten met parodontitis gediagnosticeerd door een parodontoloog, die willekeurig werden toegewezen aan de groep met alleen mondwater (26 patiënten) of de groep met mondwater plus parodontaal flosser (27 patiënten). Er werden 30 controles gerekruteerd voor de huidige studie. Voor de bepaling van orale bacterietellingen werden een real-time polymerasekettingreactie en een zuivere stam van Staphylococcus aureus met seriële verdunningen toegepast om een ​​gestandaardiseerde groeicurve te creëren voor de schatting van orale bacterietellingen in speeksel. Voorafgaand aan de interventie werd de deelnemers gevraagd om 5 ml water te spoelen om de voedselresten en andere resten in de mond uit te putten. De interventie werd aan de deelnemers gevraagd om de 15 ml mondspoeling of water gedurende 5 minuten in de mondholte te spoelen.

Deelnemers werd gevraagd naar hun gezondheidsgeschiedenis en het gebruik van hulpmiddelen voor het reinigen van tanden. De deelnemers ondergingen relevante mondgezondheidsonderzoeken en hun mondgezondheidsindices werden ook geregistreerd. Het mondwater dat voor interventie in de huidige studie werd gebruikt, was de 15 ml in de handel verkrijgbare La Chlogen-mondwater (octrooi nr. M616466 van de Republiek China) gedurende 5 minuten. Het belangrijkste ingrediënt in het mondwater is HOCl met een lage concentratie en hoge zuiverheid (100 ppm). De HOCl-oplossingen kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de La Chlogen parodontale flosser (Republic of China Patent No. M590033). De controles werden geïnstrueerd gedurende 5 minuten te gorgelen met zuiver water (15 ml). Elke deelnemer onderging eerst een pretest, waarbij nadat de speekselmonsters van de deelnemers waren verzameld, hun totale orale bacterietelling (TOBC) werd gemeten. Daarna spoelde elke deelnemer zijn mond met de hun toegewezen vloeistof (mondwater, mondwater plus parodontale flosser of water) zonder te spugen. Na 5 minuten spuugden de deelnemers de vloeistof uit, en deze speekselmonsters werden verzameld en getest om de TOBC te bepalen.

Elke deelnemer onderging twee sessies voor het verzamelen van speekselmonsters: pretest en posttest. Voorafgaand aan de speekselafname spoelde de deelnemer met 5 ml water. Hierna werd de deelnemers gevraagd om gedurende een periode van maximaal 3 minuten te spuwen in een steriele centrifugatiebuis van 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) voor het verzamelen van niet-gestimuleerd volledig speeksel. Het verzamelde monster werd vervolgens onmiddellijk in een draagbare ijsbox geplaatst voor opslag en teruggebracht naar het laboratorium voor bacteriële DNA-extractie op dezelfde dag. Het speekselvolume en het gewicht van elk monster werd ook geregistreerd vóór het bacteriële genomische DNA-extractieproces.

TOBC-analyse: Na de extractie van het bacteriële genomische DNA werden de real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR)-technieken gebruikt om het totale aantal orale bacteriën in de speekselmonsters te kwantificeren. Het speekselmonster werd gedurende 5 minuten bij 2500 rpm gecentrifugeerd. De pellet werd gesuspendeerd met 300 µl lysozymoplossing (2,5 mg/ml). Na gelijkmatig gemengd te zijn, werd het mengsel overgebracht in een eppendorfbuis van 1,5 ml en gedurende 1 uur op ijs geplaatst. Daarna werden achtereenvolgens 10% SDS (20 µl), 0,5 M EDTA (80 µl) en 20 mg/ml proteïnase K (10 µl) aan elk buisje toegevoegd; de inhoud van elke buis werd gelijkmatig gemengd en een nacht in een oven van 55°C geplaatst. Vervolgens werd 10M NH4OAC in gelijk volume aan het mengsel toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 5 minuten op ijs geplaatst en gedurende 10 minuten bij 13.000 rpm gecentrifugeerd. Het resulterende supernatant werd in een centrifugebuis van 1,5 ml geplaatst. Isopropanol werd in een gelijk volume aan het resulterende mengsel toegevoegd en het mengsel werd gedurende de nacht bij -20°C of gedurende 1 uur bij -80°C bewaard. Na 10 minuten centrifugeren bij 13.000 tpm werden de supernatanten van de neerslagen verwijderd, 75% alcohol (500 µl) werd toegevoegd en 5 minuten met rust gelaten, en het mengsel werd 10 minuten gecentrifugeerd bij 13.000 tpm. Daarna werd de alcohol verwijderd. Vervolgens werd 100% alcohol (500 µl) aan de pellet toegevoegd. Men liet het mengsel 5 minuten staan ​​en werd vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd bij 13.000 rpm. Ten slotte werd de alcohol in de buis uitgegoten en werd de centrifugebuis ondersteboven geplaatst om de resterende alcohol te laten verdampen. Ten slotte werden de DNA-precipitaten opgelost met behulp van een geschikte hoeveelheid gesteriliseerd water, gedurende 5 minuten in een oven geplaatst bij 55°C en bewaard bij -20°C. Over het algemeen hebben de DNA-monsters een OD260/OD280-verhouding van 1,4 of hoger. De concentratie van teruggewonnen DNA werd berekend op basis van een concentratie van 50 µg/ml bij OD260 = 1,00, waarvan werd vastgesteld dat deze geschikt was voor het schatten van de TOBC van elk monster na de DNA-kwantificering. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) werd gebruikt als de referentiestam bij het schatten van de bacteriegroeicurve. Na een nacht kweken werd de bacteriële oplossing vijf keer serieel verdund om monsters met verschillende concentraties S. aureus te genereren. Er werd in totaal 10 µl van elk van de monsters genomen en op het agarmedium uitgespreid om concentraties van 2,5 x 103 tot 3,9 x 107 CFU/ml te bereiken. Een volume van 1 ml van elke verschillende bacterieconcentratie werd genomen voor bacteriële DNA-extractie. Het geëxtraheerde bacteriële genomische DNA werd ingevroren bewaard bij -80°C totdat de RT-PCR-test werd uitgevoerd. Voorafgaand aan de RT-PCR-test werd de bacteriële genomische DNA-concentratie gemeten. RT-PCR-tests detecteren voornamelijk 16S-rRNA en een StepOnePlus-systeem (Applied Biosystems, Foster City, CA, VS) werd gebruikt om een ​​standaardcurve van S. aureus-concentratie vast te stellen. De sequentie van de gebruikte forward primer en reverse primer waren respectievelijk 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' en 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 De dekkingspercentages van geselecteerde voorwaartse en achterwaartse primerparen voor gewone bacteriesoorten zijn respectievelijk 94,9% en 92,8%.16 Het totale PCR-volume was 25 µl, bestaande uit 5,5 µl ddH2O, 1,0 µl 5 µM preprimer, 1,0 µl 5 µM reverse primer, 12,5 µl SYBR-oplossing en 5,0 µl (0,25 µg) DNA. De RT-PCR-reactieomstandigheden waren als volgt: 94°C gedurende 10 minuten; gevolgd door 35 cycli van 95°C gedurende 45 seconden, 58°C gedurende 40 seconden en 72°C gedurende 60 seconden; en gevolgd door een cyclus van 72°C gedurende 7 minuten. Een regressievergelijking afgeleid van de standaardcurve en de RT-PCR-resultaten werden gebruikt om de bacterieconcentratie in elk speekselmonster te berekenen. De RT-PCR-assay werd uitgevoerd in twee duplicaten voor elk monster en de variatiecoëfficiënt van de drempel varieerde tussen 2% en 12%. Menselijk bloed-DNA werd gebruikt als een negatieve controlegroep.

Antibacteriële activiteit van de mondwateroplossing: De puur gekweekte S. aureus die als standaardstam werd gebruikt, werd uitgeplaat op een kweekplaat (10 cm in diameter) die 1,5% (g/L) luria-bouillon-agar bevatte en een nacht gekweekt. Een enkele kolonie werd geselecteerd en in een erlenmeyer met LB-voedingsvloeistof geplaatst, geschud en een nacht opnieuw gekweekt, en de resulterende oplossing werd serieel verdund en op de plaat gecoat om het aantal bacteriën per volume-eenheid te berekenen. Ten slotte werd een commercieel reagens Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) gebruikt om het antibacteriële effect van het mondwater te evalueren. Elk experiment werd in tweevoud uitgevoerd. Oplossingen met verschillende kolonievormende eenheden (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 en 1000000) van S. aureus werden gedurende 5 minuten bij 2000 rpm gecentrifugeerd om de bacteriën te concentreren; nadat de vloeistof was verwijderd, werd 180 µl vers kweekmedium toegevoegd om de bacteriën in het kweekmedium te suspenderen. De bacterieoplossing werd overgebracht naar een plaat met 96 putjes. Om het antibacteriële effect van het mondwater te evalueren, werd 20 µL van het mondwater toegevoegd aan het mengsel van de bacteriële oplossing. Het mengsel werd 2 uur bij 37°C geïncubeerd. Ten slotte werd 10 µL CCK-8-reagens toegevoegd en goed gemengd. Het resulterende mengsel werd 2 uur bij 37°C geïncubeerd en de absorptie bij 450 nm werd gemeten met behulp van een ELISA-lezer. Voor de schatting van het aantal bacteriën in het mengsel en hun overlevingskans van de bacteriën kon de standaard groeicurve worden opgesteld, die vervolgens werd vergeleken met de standaard curve.

Statistische analyse: nadat de gegevensverzameling en controle waren voltooid, werden de voltooide foutopsporingsbestanden overgebracht naar een computer met statistische software voor statistische analyse. De gebruikte beschrijvende statistieken omvatten frequentieverdelingstabellen, percentages, gemiddelden en standaarddeviaties. In de TOBC-analyse werden, naast beschrijvende statistieken, een t-test, chikwadraattest en lineaire regressieanalyse uitgevoerd om de veranderingen in de bacterietellingen van het speeksel van de deelnemers na de interventieperiode te beoordelen en te vergelijken. Gezien de kleine steekproefomvang en de verdeling van TOBC, werden niet-parametrische statistische methoden gebruikt voor analyse. De Wilcoxon-rank-sum-test werd gebruikt om verschillen in de numerieke gegevens van de interventiegroep en de controlegroep te identificeren, de Wilcoxon-signed-rank-test werd gebruikt om veranderingen in numerieke gegevens tussen de baseline en post-interventie te identificeren, en de Kruskal-test. Wallis-test en een post-hoc Tukey-test werden gebruikt om verschillen in numerieke gegevens van drie of meer groepen te identificeren.