Hypoklorsyra munvatten, orala bakterier och Staphylococcus Aureus

Slutligen rekryterades 83 personer till denna studie. Totalt 53 patienter med tandlossning diagnostiserats av en parodontolog, som slumpmässigt placerades i gruppen som endast fick munvatten (26 patienter) eller gruppen med munvatten plus tandtråd (27 patienter). Det rekryterades 30 kontroller till denna studie. För bestämning av orala bakterietal applicerades en polymeraskedjereaktion i realtid och en ren stam av Staphylococcus aureus med serieutspädningar för att skapa en standardiserad tillväxtkurva för uppskattning av orala bakterietal i saliv. Före interventionen ombads deltagarna att skölja 5 ml vatten för att tömma matrester och övriga rester i munnen. Interventionen ombads deltagarna att skölja 15 ml munvatten eller vatten i 5 minuter i munhålan.

Deltagarna tillfrågades om deras hälsohistoria och användning av tandrengöringsverktyg. Deltagarna genomgick relevanta munhälsoundersökningar och deras munhälsoindex registrerades också. Munvatten som användes för intervention i föreliggande studie var 15 ml kommersiellt tillgängligt La Chlogen munvatten (Kinas patent nr. M616466) för 5 miniter. Huvudingrediensen i munvatten är lågkoncentration och hög renhet HOCl (100 ppm). HOCl-lösningarna kan också användas tillsammans med La Chlogen parodontråd (Republic of China Patent No. M590033). Kontrollerna instruerades att gurgla med rent vatten (15 ml) under 5 minuter. Varje deltagare genomgick först ett förtest, där efter att deltagarnas salivprover samlats in, mättes deras totala orala bakterietal (TOBC). Därefter sköljde varje deltagare sin mun med sin tilldelade vätska (munvatten, munvatten plus tandtråd eller vatten) utan att spotta. Efter 5 minuter spottade deltagarna ut vätskan och dessa salivprover samlades in och testades för att bestämma TOBC.

Varje deltagare genomgick två salivprovtagningssessioner: förtest och eftertest. Före salivuppsamlingen sköljde deltagaren med 5 ml vatten. Efter detta ombads deltagarna att under en maximal period av 3 minuter slemmas in i ett 50 ml sterilt centrifugeringsrör (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) för uppsamling av ostimulerad hel saliv. Det insamlade provet placerades sedan omedelbart i en bärbar islåda för förvaring, returnerades till laboratoriet för bakteriell DNA-extraktion samma dag. Salivvolymen och vikten av varje prov registrerades också före den bakteriella genomiska DNA-extraktionen.

TOBC-analys: Efter extraktion av bakteriellt genomiskt DNA, användes realtidspolymeraskedjereaktion (RT-PCR)-tekniker för att kvantifiera det totala antalet orala bakterier i salivproverna. Salivprov centrifugerades vid 2500 rpm under 5 minuter. Pelleten suspenderades med 300 ul lysozymlösning (2,5 mg/ml). Efter att ha blandats jämnt överfördes blandningen till ett 1,5 ml Eppendorf-rör och placerades på is under 1 timme. Därefter sattes 10 % SDS (20 µL), 0,5 M EDTA (80 µL) och 20 mg/ml proteinas K (10 µL) till varje rör i sekvens; innehållet i varje rör blandades jämnt och placerades i en 55°C ugn över natten. Därefter sattes 10 M NH4OAC till blandningen i lika stor volym. Blandningen placerades på is i 5 minuter och centrifugerades vid 13 000 rpm under 10 minuter. Den resulterande supernatanten placerades i ett 1,5 ml centrifugrör. Isopropanol sattes till den resulterande blandningen i lika volym och blandningen lagrades vid -20°C över natten eller -80°C under 1 timme. Efter centrifugering under 10 minuter vid 13 000 rpm avlägsnades supernatanterna från fällningarna, 75 % alkohol (500 ul) tillsattes och fick stå i 5 minuter och blandningen centrifugerades i 10 minuter vid 13 000 rpm. Alkoholen togs sedan bort. Därefter tillsattes 100 % alkohol (500 µL) till pelleten. Blandningen fick stå i 5 minuter och centrifugerades därefter i 10 minuter vid 13 000 rpm. Slutligen hälldes alkoholen i röret ut och centrifugröret placerades upp och ner för att tillåta eventuell kvarvarande alkohol att avdunsta. Slutligen löstes DNA-fällningarna med användning av en lämplig mängd steriliserat vatten, placerades i en ugn vid 55°C under 5 minuter och förvarades vid -20°C. I allmänhet har DNA-proverna ett OD260/OD280-förhållande på 1,4 eller högre. Koncentrationen av återvunnet DNA beräknades på basis av en koncentration av 50 µg/ml vid OD260 = 1,00, vilket fastställdes vara lämpligt för att uppskatta TOBC för varje prov efter DNA-kvantifieringen. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) användes som referensstam vid uppskattning av bakterietillväxtkurvan. Efter odling över natten serieutspäddes bakterielösningen fem gånger för att generera prover med olika koncentrationer av S. aureus. Totalt 10 µL av vart och ett av proverna togs och spreds på agarmediet för att uppnå koncentrationer på 2,5 × 103 till 3,9 × 107 CFU/ml. En volym på 1 ml av varje olika bakteriekoncentration togs för bakteriell DNA-extraktion. Det extraherade bakteriella genomiska DNA:t förvarades fryst vid -80°C tills RT-PCR-testet utfördes. Före RT-PCR-testet mättes den bakteriella genomiska DNA-koncentrationen. RT-PCR-tester detekterar huvudsakligen 16S rRNA, och ett StepOnePlus-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) användes för att fastställa en standardkurva för S. aureus-koncentration. Sekvensen för den framåtriktade primern och den omvända primern som användes var 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' respektive 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 Täckningsgraden för utvalda framåt- och bakåtprimerpar för vanliga bakteriearter är 94,9 % respektive 92,8 %.16 Den totala PCR-volymen var 25 µL, innefattande 5,5 µL ddH2O, 1,0 µL 5-µM preprimer, 1,0 µL 5-µM omvänd primer, 12,5 µL SYBR-lösning och 5,0 µl DNA (0,2 µg.) RT-PCR-reaktionsbetingelserna var som följer: 94°C under 10 minuter; följt av 35 cykler av 95°C i 45 sekunder, 58°C i 40 sekunder och 72°C i 60 sekunder; och följt av en cykel vid 72°C under 7 minuter. En regressionsekvation härledd från standardkurvan och RT-PCR-resultaten användes för att beräkna bakteriekoncentrationen i varje salivprov. RT-PCR-analysen utfördes två dubbletter för varje prov, och variationskoefficienten för tröskelvärdet varierades mellan 2 % och 12 %. Humant blod-DNA användes som en negativ kontrollgrupp.

Antibakteriell aktivitet hos munvattenlösningen: Den renodlade S. aureus som användes som standardstammen ströks ut på en odlingsplatta (10 cm i diameter) innehållande 1,5 % (g/l) luriabuljongagar och odlades över natten. En enda koloni valdes ut och placerades i en konisk kolv innehållande LB-näringsvätska, skakades och återodlades över natten, och den resulterande lösningen späddes i serie och belades på plattan för att beräkna antalet bakterier per volymenhet. Slutligen användes ett kommersiellt reagens för cellräkningskit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) för att utvärdera den antibakteriella effekten av munvatten. Varje experiment utfördes i duplikat. Lösningar innehållande olika kolonibildande enheter (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 och 1000000) av S. aureus centrifugerades vid 2000 rpm under 5 minuter för att koncentrera bakterierna; efter att vätskan avlägsnats tillsattes 180 µL färskt odlingsmedium för att suspendera bakterierna i odlingsmediet. Bakterielösningen överfördes till en platta med 96 brunnar. För att utvärdera den antibakteriella effekten av munvatten sattes 20 µL av munvatten till blandningen av bakterielösningen. Blandningen inkuberades vid 37°C under 2 timmar. Slutligen tillsattes 10 µL CCK-8-reagens och blandades väl. Den resulterande blandningen inkuberades vid 37°C under 2 timmar, och absorbansen vid 450 nm mättes med användning av en ELISA-läsare. Standardtillväxtkurvan kunde fastställas för uppskattning av antalet bakterier i blandningen och deras överlevnadshastighet för bakterierna, som sedan jämfördes med standardkurvan.

Statistisk analys: Efter att datainsamlingen och kontrollen var klar överfördes de slutförda felsökta filerna till en dator med statistisk programvara för statistisk analys. Den beskrivande statistik som användes inkluderade frekvensfördelningstabeller, procentsatser, medelvärden och standardavvikelser. I TOBC-analysen genomfördes, förutom beskrivande statistik, ett t-test, chi-kvadrattest och linjär regressionsanalys för att bedöma och jämföra förändringarna i bakterieantalet i deltagarnas saliv efter interventionsperioden. Med tanke på den lilla provstorleken och fördelningen av TOBC, användes icke-parametriska statistiska metoder för analys. Wilcoxon rank-summetest användes för att identifiera skillnader i numeriska data för interventionsgruppen och kontrollgruppen, Wilcoxon signed-rank testet användes för att identifiera förändringar i numeriska data mellan baslinjen och post-interventionen, och Kruskal- Wallis-test och ett post hoc Tukey-test användes för att identifiera skillnader i numeriska data för tre eller flera grupper.