하이포아염소산 구강청결제, 구강 박테리아 및 황색포도상구균

마지막으로 본 연구에 모집된 사람은 83명이었습니다. 치주과 전문의가 진단한 치주질환 환자 총 53명을 구강세정제만 사용한 그룹(26명) 또는 구강청결제 + 치실세제 그룹(27명)으로 무작위 배정했습니다. 본 연구에 모집된 30개의 대조군이 있었다. 구강세균수 측정을 위해 실시간 중합효소연쇄반응과 연속희석액이 포함된 순수 황색포도상구균 균주를 적용하여 타액 내 구강세균수 추정을 위한 표준화된 성장 곡선을 만들었습니다. 개입 전에 참가자들에게 5ml의 물을 헹구어 음식물 찌꺼기와 입안의 ​​다른 잔류물을 고갈시키도록 요청했습니다. 중재는 참가자들에게 15ml 구강 세척제 또는 물로 5분 동안 구강 내에서 헹구도록 요청했습니다.

참가자들에게 건강 이력과 치아 청소 도구 사용에 대해 질문했습니다. 참가자들은 관련 구강 건강 검진을 받았고 구강 건강 지수도 기록되었습니다. 본 연구에서 중재에 사용된 구강청결제는 시중에서 판매되는 La Chlogen 구강청정제(중화민국 특허번호 M616466) 15mL 5분용이었다. 구강청결제의 주성분은 저농도 고순도 HOCl(100ppm)입니다. HOCl 솔루션은 La Chlogen 치주 치실과 함께 사용할 수도 있습니다(중화민국 특허 번호 M590033). 대조군은 순수한 물(15ml)로 5분 동안 가글하도록 지시받았다. 각 참가자는 먼저 참가자의 타액 샘플을 수집한 후 총 구강 세균 수(TOBC)를 측정하는 사전 테스트를 받았습니다. 그 후, 각 참가자는 침을 뱉지 않고 할당된 액체(구강 세정제, 구강 세정제 + 치실 또는 물)로 입을 헹구었습니다. 5분 후, 참가자들은 액체를 뱉어내고 이러한 타액 샘플을 수집하여 TOBC를 결정하기 위해 테스트했습니다.

각 참가자는 사전 테스트와 사후 테스트의 두 가지 타액 샘플 수집 세션을 거쳤습니다. 타액 채취 전에 참가자는 5ml의 물로 헹구었습니다. 그 후, 참여자들은 자극되지 않은 전체 타액을 수집하기 위해 50ml 멸균 원심분리 튜브(Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan)에 최대 3분 동안 가래를 뱉도록 요청받았습니다. 수집된 검체는 보관을 위해 즉시 휴대용 아이스박스에 넣고 당일 박테리아 DNA 추출을 위해 실험실로 반환했습니다. 박테리아 게놈 DNA 추출 과정 전에 각 샘플의 타액 부피와 무게도 기록되었습니다.

TOBC 분석: 박테리아 게놈 DNA를 추출한 후 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 기술을 사용하여 타액 샘플의 총 구강 박테리아 수를 정량화했습니다. 타액 샘플을 2500rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. 펠릿을 300μl 라이소자임 용액(2.5mg/mL)으로 현탁시켰다. 균일하게 혼합한 후, 혼합물을 1.5mL 에펜도르프 튜브로 옮기고 얼음에 1시간 동안 두었다. 그 후, 10% SDS(20µL), 0.5M EDTA(80µL) 및 20mg/mL proteinase K(10µL)를 순서대로 각 튜브에 첨가했습니다. 각 튜브의 내용물을 균일하게 혼합하고 밤새 55°C 오븐에 두었습니다. 다음으로, 10M NH4OAC를 동일한 부피로 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에 5분 동안 두고 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 생성된 상등액을 1.5mL 원심분리관에 넣었다. 생성된 혼합물에 이소프로판올을 동량으로 첨가하고, 혼합물을 -20℃에서 밤새 또는 -80℃에서 1시간 동안 보관하였다. 13,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 침전물에서 상등액을 제거하고 75% 알코올(500μL)을 첨가하여 5분간 방치한 후 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 그런 다음 알코올을 제거했습니다. 다음으로, 100% 알코올(500µL)을 펠렛에 첨가했습니다. 혼합물을 5분 동안 방치한 후 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 마지막으로 튜브 안의 알코올을 따라내고 원심분리기 튜브를 거꾸로 놓아 남아있는 알코올이 모두 증발되도록 하였다. 마지막으로 DNA 침전물을 적당량의 멸균수로 녹인 후 55℃ 오븐에 5분 동안 넣어 -20℃에 보관하였다. 일반적으로 OD260/OD280 비율이 1.4 이상인 DNA 표본. 회수된 DNA의 농도는 OD260 = 1.00에서 50 µg/mL 농도를 기준으로 계산하였으며, 이는 DNA 정량 후 각 시료의 TOBC 추정에 적합하다고 판단되었다. Staphylococcus aureus(ATCC 29213)는 박테리아 성장 곡선 추정에서 참조 균주로 사용되었습니다. 밤새 배양한 후, 박테리아 용액을 5배 연속 희석하여 다양한 농도의 S. 아우레우스를 갖는 표본을 생성하였다. 각 시료의 총 10 μL를 취하여 2.5 × 103 ~ 3.9 × 107 CFU/mL의 농도가 되도록 한천 배지에 펴 바릅니다. 박테리아 DNA 추출을 위해 각각 다른 박테리아 농도의 1mL 부피를 취했습니다. 추출된 박테리아 게놈 DNA는 RT-PCR 검사를 수행하기 전까지 -80°C에서 냉동 보관하였다. RT-PCR 검사 전에 세균의 게놈 DNA 농도를 측정하였다. RT-PCR 검사는 주로 16S rRNA를 검출하며, S. aureus 농도의 표준 곡선을 설정하기 위해 StepOnePlus 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용했습니다. 사용된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 서열은 각각 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' 및 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'이었다.16 일반적인 박테리아 종에 대해 선택된 정방향 및 역방향 프라이머 쌍의 적용률은 각각 94.9% 및 92.8%입니다.16 총 PCR 부피는 25uL였으며, ddH2O 5.5µL, 5µM 프리프라이머 1.0µL, 5µM 역방향 프라이머 1.0µL, SYBR 용액 12.5µL, DNA 5.0µL(0.25µg)로 구성되었습니다. RT-PCR 반응 조건은 다음과 같다: 94℃에서 10분; 이어서 95℃에서 45초, 58℃에서 40초, 72℃에서 60초의 35주기; 7분 동안 72°C의 한 주기가 이어집니다. 표준 곡선과 RT-PCR 결과에서 파생된 회귀 방정식을 사용하여 각 타액 샘플의 세균 농도를 계산했습니다. RT-PCR 분석은 각 샘플에 대해 두 번 중복 수행되었으며 임계값의 변동 계수는 2%에서 12% 사이로 다양했습니다. 인간 혈액 DNA는 음성 대조군으로 사용되었습니다.

구강세척액의 항균활성: 표준균주로 사용된 순수배양 S. aureus를 1.5%(g/L) luria broth agar가 포함된 배양접시(지름 10cm)에 도말하여 밤새 배양하였다. 하나의 콜로니를 선택하여 LB 영양액이 담긴 코니칼 플라스크에 넣고 진탕한 후 하룻밤 동안 재배양한 용액을 순차적으로 희석하여 플레이트에 코팅하여 단위 부피당 균수를 계산하였다. 마지막으로 Cell Counting Kit 8(CCK-8, Engreen Biosystem) 상용 시약을 사용하여 구강청결제의 항균 효과를 평가하였다. 각 실험은 두 번 수행되었습니다. S. aureus의 서로 다른 콜로니 형성 단위(0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 및 1000000)를 포함하는 용액을 2000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 농축했습니다. 액체를 제거한 후, 180μL의 신선한 배양 배지를 첨가하여 배양 배지에 박테리아를 현탁시켰다. 박테리아 용액을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 구강 세정제의 항균 효과를 평가하기 위해 구강 세정제 20 μL를 세균 용액의 혼합물에 첨가했습니다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, CCK-8 시약 10μL를 첨가하고 잘 혼합하였다. 생성된 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, ELISA 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혼합물의 세균 수와 세균의 생존율을 추정하기 위해 표준 성장 곡선을 설정하고 표준 곡선과 비교했습니다.

통계 분석: 데이터 수집 및 확인이 완료된 후 최종 디버깅된 파일을 통계 분석을 위해 통계 소프트웨어가 있는 컴퓨터로 전송했습니다. 사용된 기술 통계에는 빈도 분포표, 백분율, 평균 및 표준 편차가 포함됩니다. TOBC 분석에서는 기술통계 외에 개입기간 후 참여자의 타액의 세균수 변화를 평가하고 비교하기 위해 t 검정, 카이제곱 검정, 선형회귀분석을 실시하였다. 작은 표본 크기와 TOBC의 분포를 고려하여 비모수 통계 방법을 사용하여 분석했습니다. 중재군과 대조군의 수치 데이터 차이를 확인하기 위해 Wilcoxon rank-sum test를, 기준선과 중재 후 수치 데이터의 변화를 확인하기 위해 Wilcoxon signed-rank test를, Kruskal- Wallis 검정과 사후 Tukey 검정을 사용하여 3개 이상의 그룹의 수치 데이터 차이를 확인했습니다.