Collutorio all'acido ipocloroso, batteri orali e stafilococco aureo

Infine, nel presente studio sono state reclutate 83 persone. Un totale di 53 pazienti con malattia parodontale diagnosticata da un parodontologo, che sono stati assegnati in modo casuale al gruppo solo collutorio (26 pazienti) o al gruppo collutorio più filo interdentale (27 pazienti). C'erano 30 controlli reclutati nel presente studio. Per la determinazione della conta batterica orale, sono stati applicati una reazione a catena della polimerasi in tempo reale e un ceppo puro di Staphylococcus aureus con diluizioni seriali per creare una curva di crescita standardizzata per la stima della conta batterica orale nella saliva. Prima dell'intervento, ai partecipanti è stato chiesto di sciacquare 5 ml di acqua per esaurire i residui di cibo e gli altri residui in bocca. L'intervento è stato chiesto ai partecipanti di sciacquare i 15 ml di collutorio o acqua per 5 minuti nella cavità orale.

Ai partecipanti è stata chiesta la loro storia sanitaria e l'uso di strumenti per la pulizia dentale. I partecipanti sono stati sottoposti a pertinenti esami di salute orale e sono stati registrati anche i loro indici di salute orale. Il collutorio utilizzato per l'intervento nel presente studio era il 15 ml di collutorio La Chlogen disponibile in commercio (Repubblica di Cina brevetto n. M616466) per 5 miniti. L'ingrediente principale del collutorio è HOCl ad alta purezza a bassa concentrazione (100 ppm). Le soluzioni HOCl possono essere utilizzate anche in combinazione con il filo interdentale parodontale La Chlogen (brevetto della Repubblica di Cina n. M590033). I controlli sono stati istruiti a fare gargarismi con acqua pura (15 ml) per 5 minuti. Ogni partecipante è stato prima sottoposto a un pre-test, in cui dopo che i campioni di saliva dei partecipanti sono stati raccolti, è stata misurata la loro conta batterica orale totale (TOBC). Successivamente, ogni partecipante si è sciacquato la bocca con il liquido assegnato (collutorio, collutorio più filo interdentale o acqua) senza sputare. Dopo 5 minuti, i partecipanti sputavano il liquido e questi campioni di saliva venivano raccolti e testati per determinare il TOBC.

Ogni partecipante è stato sottoposto a due sessioni di raccolta del campione di saliva: pretest e posttest. Prima della raccolta della saliva, il partecipante si è sciacquato con 5 ml di acqua. Successivamente, ai partecipanti è stato chiesto di espettorare per un periodo massimo di 3 minuti in un tubo di centrifugazione sterile da 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) per la raccolta di saliva intera non stimolata. Il campione raccolto è stato quindi immediatamente posto in una ghiacciaia portatile per la conservazione, restituito al laboratorio per l'estrazione del DNA batterico in giornata. Anche il volume e il peso della saliva di ciascun campione sono stati registrati prima del processo di estrazione del DNA genomico batterico.

Analisi TOBC: dopo l'estrazione del DNA genomico batterico, sono state utilizzate le tecniche di reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per quantificare la conta totale dei batteri orali nei campioni di saliva. Il campione di saliva è stato centrifugato a 2500 rpm per 5 minuti. Il pellet è stato sospeso con 300 µl di soluzione di lisozima (2,5 mg/mL). Dopo essere stata miscelata uniformemente, la miscela è stata trasferita in una provetta eppendorf da 1,5 ml e posta in ghiaccio per 1 ora. Successivamente, a ciascuna provetta in sequenza sono stati aggiunti 10% SDS (20 µL), 0,5 M EDTA (80 µL) e 20 mg/mL di proteinasi K (10 µL); il contenuto di ciascuna provetta è stato miscelato uniformemente e posto in un forno a 55°C per una notte. Successivamente, alla miscela è stato aggiunto NH4OAC 10 M in volume uguale. La miscela è stata posta in ghiaccio per 5 minuti e centrifugata a 13.000 rpm per 10 minuti. Il surnatante risultante è stato posto in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Alla miscela risultante è stato aggiunto isopropanolo in volume uguale e la miscela è stata conservata a -20°C per una notte o a -80°C per 1 ora. Dopo centrifugazione per 10 minuti a 13.000 rpm, i supernatanti sono stati rimossi dai precipitati, è stato aggiunto alcool al 75% (500 µL) e lasciato a riposo per 5 minuti, e la miscela è stata centrifugata per 10 minuti a 13.000 rpm. L'alcool è stato quindi rimosso. Successivamente, al pellet è stato aggiunto alcool al 100% (500 µL). La miscela è stata lasciata a riposo per 5 minuti e successivamente centrifugata per 10 minuti a 13.000 rpm. Infine, l'alcool nella provetta è stato versato e la provetta da centrifuga è stata capovolta per consentire l'evaporazione dell'alcool residuo. Infine, i precipitati di DNA sono stati sciolti utilizzando una quantità appropriata di acqua sterilizzata, posti in un forno a 55°C per 5 minuti e conservati a -20°C. Generalmente, i campioni di DNA con un rapporto OD260/OD280 di 1,4 o superiore. La concentrazione del DNA recuperato è stata calcolata sulla base di una concentrazione di 50 µg/mL a OD260 = 1,00, che è stata ritenuta adatta per stimare il TOBC di ciascun campione dopo la quantificazione del DNA. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) è stato utilizzato come ceppo di riferimento nella stima della curva di crescita batterica. Dopo la coltura durante la notte, la soluzione batterica è stata diluita in serie cinque volte per generare campioni con diverse concentrazioni di S. aureus. Sono stati prelevati un totale di 10 µL di ciascuno dei campioni e sparsi sul terreno agar per raggiungere concentrazioni da 2,5 × 103 a 3,9 × 107 CFU/mL. Un volume di 1 mL di ciascuna diversa concentrazione batterica è stato prelevato per l'estrazione del DNA batterico. Il DNA genomico batterico estratto è stato conservato congelato a -80°C fino all'esecuzione del test RT-PCR. Prima del test RT-PCR, è stata misurata la concentrazione di DNA genomico batterico. I test RT-PCR rilevano principalmente l'rRNA 16S e un sistema StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) è stato utilizzato per stabilire una curva standard della concentrazione di S. aureus. La sequenza del forward primer e del reverse primer utilizzati era rispettivamente 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' e 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 I tassi di copertura della coppia di primer diretti e inversi selezionati per le specie batteriche comuni sono rispettivamente del 94,9% e del 92,8%.16 Il volume totale della PCR era di 25 μL, comprendente 5,5 μL di ddH2O, 1,0 μL di preprimer 5-μM, 1,0 μL di reverse primer 5-μM, 12,5 μL di soluzione SYBR e 5,0 μL (0,25 μg) di DNA. Le condizioni di reazione RT-PCR erano le seguenti: 94°C per 10 minuti; seguito da 35 cicli di 95°C per 45 secondi, 58°C per 40 secondi e 72°C per 60 secondi; e seguito da un ciclo di 72°C per 7 minuti. Un'equazione di regressione derivata dalla curva standard ei risultati RT-PCR sono stati utilizzati per calcolare la concentrazione batterica in ciascun campione di saliva. Il test RT-PCR è stato condotto in due duplicati per ciascun campione e il coefficiente di variazione della soglia è stato variato tra il 2% e il 12%. Il DNA del sangue umano è stato utilizzato come gruppo di controllo negativo.

Attività antibatterica della soluzione per collutorio: lo S. aureus in coltura pura utilizzato come ceppo standard è stato piastrato su una piastra di coltura (10 cm di diametro) contenente 1,5% (g/L) di luria broth agar e messo in coltura durante la notte. Una singola colonia è stata selezionata e posta in una beuta contenente liquido nutritivo LB, agitata e ricoltivata durante la notte, e la soluzione risultante è stata diluita in serie e rivestita sulla piastra per calcolare il numero di batteri per unità di volume. Infine, è stato utilizzato un reagente commerciale Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) per valutare l'effetto antibatterico del collutorio. Ogni esperimento è stato eseguito in duplicato. Le soluzioni contenenti diverse unità formanti colonia (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 e 1000000) di S. aureus sono state centrifugate a 2000 rpm per 5 minuti per concentrare i batteri; dopo che il liquido è stato rimosso, sono stati aggiunti 180 µL di terreno di coltura fresco per sospendere i batteri nel terreno di coltura. La soluzione batterica è stata trasferita in una piastra a 96 pozzetti. Per valutare l'effetto antibatterico del collutorio, alla miscela della soluzione batterica sono stati aggiunti 20 µL di collutorio. La miscela è stata incubata a 37°C per 2 ore. Infine, sono stati aggiunti 10 µL di reagente CCK-8 e miscelati bene. La miscela risultante è stata incubata a 37°C per 2 ore e l'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore ELISA. È stato possibile stabilire la curva di crescita standard per la stima del numero di batteri nella miscela e il loro tasso di sopravvivenza dei batteri, che sono stati poi confrontati con la curva standard.

Analisi statistica: dopo che la raccolta e il controllo dei dati sono stati completati, i file di debug finalizzati sono stati trasferiti su un computer con software statistico per l'analisi statistica. Le statistiche descrittive utilizzate includevano tabelle di distribuzione della frequenza, percentuali, medie e deviazioni standard. Nell'analisi TOBC, oltre alle statistiche descrittive, sono stati condotti test t, test chi-quadrato e analisi di regressione lineare per valutare e confrontare i cambiamenti nelle conte batteriche della saliva dei partecipanti dopo il periodo di intervento. Considerando la piccola dimensione del campione e la distribuzione del TOBC, per l'analisi sono stati utilizzati metodi statistici non parametrici. Il test della somma dei ranghi di Wilcoxon è stato utilizzato per identificare le differenze nei dati numerici del gruppo di intervento e del gruppo di controllo, il test dei ranghi con segno di Wilcoxon è stato utilizzato per identificare i cambiamenti nei dati numerici tra il basale e il post-intervento e il test di Kruskal- Il test di Wallis e un test di Tukey post hoc sono stati utilizzati per identificare le differenze nei dati numerici di tre o più gruppi.