Hypoklorsyre mundskyl, orale bakterier og Staphylococcus Aureus

Endelig blev der rekrutteret 83 personer til denne undersøgelse. I alt 53 patienter med paradentose diagnosticeret af en paradentoselæge, som blev tilfældigt fordelt til gruppen med kun mundskyl (26 patienter) eller mundskyl plus tandtrådsgruppen (27 patienter). Der blev rekrutteret 30 kontroller til denne undersøgelse. Til bestemmelse af orale bakterietal blev der anvendt en polymerasekædereaktion i realtid og en ren stamme af Staphylococcus aureus med seriefortyndinger for at skabe en standardiseret vækstkurve til estimering af orale bakterietal i spyt. Før interventionen blev deltagerne bedt om at skylle 5 ml vand for at udtømme madrester og de øvrige rester i munden. Interventionen blev bedt deltagerne om at skylle 15 ml mundskyl eller vand i 5 minutter i mundhulen.

Deltagerne blev spurgt om deres helbredshistorie og brug af tandrenseværktøjer. Deltagerne gennemgik relevante mundsundhedsundersøgelser, og deres mundsundhedsindeks blev også registreret. Mundskylningen, der blev brugt til intervention i nærværende undersøgelse, var de 15 ml kommercielt tilgængelig La Chlogen mundskyl (Republic of China Patent No. M616466) til 5 minites. Hovedingrediensen i mundskyllevandet er lavkoncentreret HOCl med høj renhed (100 ppm). HOCl-opløsningerne kan også anvendes i forbindelse med La Chlogen parodontråd (Republic of China Patent No. M590033). Kontrollerne blev instrueret i at gurgle med rent vand (15 ml) i 5 minutter. Hver deltager gennemgik først en prætest, hvor efter at deltagernes spytprøver var blevet indsamlet, blev deres totale orale bakterietal (TOBC) målt. Derefter skyllede hver deltager deres mund med deres tildelte væske (mundskyl, mundskyl plus parodontose eller vand) uden at spytte. Efter 5 minutter spyttede deltagerne væsken ud, og disse spytprøver blev opsamlet og testet for at bestemme TOBC.

Hver deltager gennemgik to spytprøvetagningssessioner: prætest og posttest. Før spytopsamlingen skyllede deltageren med 5 ml vand. Herefter blev deltagerne bedt om at ekspektorere over en maksimal periode på 3 minutter i et 50 ml sterilt centrifugeringsrør (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) til opsamling af ustimuleret hel spyt. Den indsamlede prøve blev derefter straks anbragt i en bærbar isboks til opbevaring, returneret til laboratoriet til samme dag bakteriel DNA-ekstraktion. Spytvolumenet og vægten af ​​hver prøve blev også registreret før den bakterielle genomiske DNA-ekstraktionsproces.

TOBC-analyse: Efter ekstraktion af det bakterielle genomiske DNA blev real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) teknikkerne brugt til at kvantificere det samlede antal orale bakterier i spytprøverne. Spytprøven blev centrifugeret ved 2500 rpm i 5 minutter. Pelleten blev suspenderet med 300 µl lysozymopløsning (2,5 mg/ml). Efter at være blevet blandet jævnt, blev blandingen overført til et 1,5 ml Eppendorf-rør og anbragt på is i 1 time. Derefter blev 10 % SDS (20 µL), 0,5 M EDTA (80 µL) og 20 mg/ml proteinase K (10 µL) tilsat til hvert rør i rækkefølge; indholdet af hvert rør blev blandet jævnt og anbragt i en 55°C ovn natten over. Dernæst blev 10M NH4OAC tilsat til blandingen i lige volumen. Blandingen blev anbragt på is i 5 minutter og centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 minutter. Den resulterende supernatant blev anbragt i et 1,5 ml centrifugerør. Isopropanol blev tilsat til den resulterende blanding i lige volumen, og blandingen blev opbevaret ved -20°C natten over eller -80°C i 1 time. Efter centrifugering i 10 minutter ved 13.000 rpm blev supernatanterne fjernet fra præcipitaterne, 75% alkohol (500 µl) blev tilsat og henstået i 5 minutter, og blandingen blev centrifugeret i 10 minutter ved 13.000 rpm. Alkoholen blev derefter fjernet. Derefter blev 100 % alkohol (500 µL) tilsat til pelleten. Blandingen henstod i 5 minutter og centrifugeredes efterfølgende i 10 minutter ved 13.000 rpm. Til sidst blev alkoholen i røret hældt ud, og centrifugerøret blev placeret på hovedet for at lade eventuel resterende alkohol fordampe. Til sidst blev DNA-præcipitaterne opløst under anvendelse af en passende mængde steriliseret vand, anbragt i en ovn ved 55°C i 5 minutter og opbevaret ved -20°C. Generelt har DNA-prøverne et OD260/OD280-forhold på 1,4 eller højere. Koncentrationen af ​​genvundet DNA blev beregnet på basis af en koncentration på 50 µg/ml ved OD260 = 1,00, som blev bestemt til at være egnet til at estimere TOBC af hver prøve efter DNA-kvantificeringen. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) blev anvendt som referencestamme ved estimering af bakteriel vækstkurve. Efter dyrkning natten over blev bakterieopløsningen seriefortyndet fem gange for at generere prøver med forskellige koncentrationer af S. aureus. I alt 10 µL af hver af prøverne blev taget og spredt på agarmediet for at opnå koncentrationer på 2,5 × 103 til 3,9 × 107 CFU/ml. Et volumen på 1 ml af hver forskellig bakteriekoncentration blev taget til bakteriel DNA-ekstraktion. Det ekstraherede bakterielle genomiske DNA blev opbevaret frosset ved -80°C, indtil RT-PCR-testen blev udført. Før RT-PCR-testen blev den bakterielle genomiske DNA-koncentration målt. RT-PCR-tests detekterer hovedsageligt 16S rRNA, og et StepOnePlus-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) blev brugt til at etablere en standardkurve for S. aureus-koncentration. Sekvensen af ​​den anvendte fremadrettede primer og omvendte primer var henholdsvis 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' og 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 Dækningsgraden for udvalgte frem- og omvendte primerpar for almindelige bakteriearter er henholdsvis 94,9 % og 92,8 %.16 Det totale PCR-volumen var 25 µL, omfattende 5,5 µL ddH2O, 1,0 µL 5-µM præprimer, 1,0 µL 5-µM omvendt primer, 12,5 µL SYBR-opløsning og 5,0 µL (0,0 µl) DNA. RT-PCR-reaktionsbetingelserne var som følger: 94°C i 10 minutter; efterfulgt af 35 cyklusser af 95°C i 45 sekunder, 58°C i 40 sekunder og 72°C i 60 sekunder; og efterfulgt af en cyklus ved 72°C i 7 minutter. En regressionsligning afledt af standardkurven og RT-PCR-resultaterne blev brugt til at beregne bakteriekoncentrationen i hver spytprøve. RT-PCR-assayet blev udført to duplikater for hver prøve, og variationskoefficienten for tærsklen blev varieret mellem 2% og 12%. Humant blod-DNA blev brugt som en negativ kontrolgruppe.

Antibakteriel aktivitet af mundskylleopløsningen: Den rendyrkede S. aureus anvendt som standardstammen blev udpladet på en dyrkningsplade (10 cm i diameter) indeholdende 1,5 % (g/l) luriabouillon-agar og dyrket natten over. En enkelt koloni blev udvalgt og anbragt i en konisk kolbe indeholdende LB-næringsvæske, rystet og gendyrket natten over, og den resulterende opløsning blev seriefortyndet og coatet på pladen for at beregne antallet af bakterier pr. volumenenhed. Endelig blev et kommercielt reagens til celletællingskit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) brugt til at evaluere den antibakterielle virkning af mundskylningen. Hvert eksperiment blev udført i to eksemplarer. Opløsninger indeholdende forskellige kolonidannende enheder (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 og 1000000) af S. aureus blev centrifugeret ved 2000 rpm i 5 minutter for at koncentrere bakterierne; efter at væsken var fjernet, blev 180 µL frisk dyrkningsmedium tilsat for at suspendere bakterierne i dyrkningsmediet. Bakterieopløsningen blev overført til en plade med 96 brønde. For at evaluere den antibakterielle virkning af mundskyllevandet blev 20 µL af mundskyllemidlet tilsat til blandingen af ​​bakterieopløsningen. Blandingen blev inkuberet ved 37°C i 2 timer. Til sidst blev 10 µL CCK-8-reagens tilsat og blandet godt. Den resulterende blanding blev inkuberet ved 37°C i 2 timer, og absorbansen ved 450 nm blev målt under anvendelse af en ELISA-læser. Standard vækstkurven kunne etableres til estimering af antallet af bakterier i blandingen og deres overlevelsesrate for bakterierne, som derefter blev sammenlignet med standardkurven.

Statistisk analyse: Efter at dataindsamlingen og kontrollen var afsluttet, blev de færdige debuggede filer overført til en computer med statistisk software til statistisk analyse. Den anvendte beskrivende statistik omfattede frekvensfordelingstabeller, procenter, middelværdier og standardafvigelser. I TOBC-analysen blev der udover beskrivende statistik gennemført en t-test, chi-kvadrat-test og lineær regressionsanalyse for at vurdere og sammenligne ændringerne i bakterietallet i deltagernes spyt efter interventionsperioden. I betragtning af den lille stikprøvestørrelse og fordelingen af ​​TOBC blev ikke-parametriske statistiske metoder brugt til analyse. Wilcoxon rank-sum test blev brugt til at identificere forskelle i de numeriske data for interventionsgruppen og kontrolgruppen, Wilcoxon signed-rank testen blev brugt til at identificere ændringer i numeriske data mellem baseline og post-intervention, og Kruskal- Wallis test og en post hoc Tukey test blev brugt til at identificere forskelle i numeriske data for tre eller flere grupper.