Ústní voda s kyselinou chlornou, ústní bakterie a Staphylococcus Aureus

Nakonec bylo do této studie přijato 83 osob. Celkem 53 pacientů s periodontálním onemocněním diagnostikovaným parodontologem, kteří byli náhodně zařazeni do skupiny pouze s ústní vodou (26 pacientů) nebo do skupiny ústní voda plus parodontální flosser (27 pacientů). Do této studie bylo přijato 30 kontrol. Pro stanovení počtu orálních bakterií byla použita polymerázová řetězová reakce v reálném čase a čistý kmen Staphylococcus aureus se sériovým ředěním, aby se vytvořila standardizovaná růstová křivka pro odhad počtu orálních bakterií ve slinách. Před intervencí byli účastníci požádáni, aby vypláchli 5 ml vody, aby se odstranily zbytky jídla a ostatní zbytky v ústech. Účastníci intervence byli požádáni, aby vyplachovali 15 ml ústní vody nebo vody po dobu 5 minut v dutině ústní.

Účastníci byli dotázáni na jejich zdravotní historii a používání nástrojů pro čištění zubů. Účastníci absolvovali příslušná vyšetření ústního zdraví a byly zaznamenávány i jejich indexy ústního zdraví. Ústní voda použitá pro intervenci v této studii byla 15 ml komerčně dostupné ústní vody La Chlogen (Čínský patent č. M616466) pro 5 minut. Hlavní složkou ústní vody je nízkokoncentrovaný vysoce čistý HOCl (100 ppm). Roztoky HOCl lze také použít ve spojení s periodontálním vláknitým přístrojem La Chlogen (patent Čínské republiky č. M590033). Kontroly byly instruovány, aby kloktaly čistou vodou (15 ml) po dobu 5 minut. Každý účastník nejprve podstoupil předtest, ve kterém poté, co byly účastníkům odebrány vzorky slin, byl změřen jejich celkový počet bakterií v ústech (TOBC). Poté si každý účastník vypláchl ústa svou přidělenou tekutinou (ústní vodou, ústní vodou plus parodontální nití nebo vodou) bez plivání. Po 5 minutách účastníci vyplivli tekutinu a tyto vzorky slin byly odebrány a testovány pro stanovení TOBC.

Každý účastník podstoupil dva odběry vzorků slin: pretest a posttest. Před odběrem slin se účastník opláchl 5 ml vody. Poté byli účastníci požádáni, aby expektorovali po dobu maximálně 3 minut do 50ml sterilní centrifugační zkumavky (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) pro odběr nestimulovaných celých slin. Odebraný vzorek byl poté okamžitě umístěn do přenosného ledového boxu pro skladování a vrácen do laboratoře pro extrakci bakteriální DNA ve stejný den. Objem slin a hmotnost každého vzorku byly také zaznamenány před procesem extrakce bakteriální genomové DNA.

Analýza TOBC: Po extrakci bakteriální genomové DNA byly ke kvantifikaci celkového počtu orálních bakterií ve vzorcích slin použity techniky polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RT-PCR). Vzorek slin byl centrifugován při 2500 ot./min. po dobu 5 minut. Peleta byla suspendována s 300 ul roztoku lysozymu (2,5 mg/ml). Po rovnoměrném promíchání byla směs přenesena do 1,5ml eppendorfovy zkumavky a umístěna na led na 1 hodinu. Poté byly do každé zkumavky postupně přidány 10% SDS (20 ul), 0,5M EDTA (80 ul) a 20 mg/ml proteinázy K (10 ul); obsah každé zkumavky byl rovnoměrně promíchán a umístěn do sušárny o teplotě 55 °C přes noc. Dále byl ke směsi přidán 10M NH4OAC ve stejném objemu. Směs byla umístěna na led na 5 minut a odstřeďována při 13 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Výsledný supernatant byl umístěn do 1,5ml centrifugační zkumavky. K výsledné směsi byl přidán isopropanol ve stejném objemu a směs byla skladována při -20 °C přes noc nebo -80 °C po dobu 1 hodiny. Po centrifugaci po dobu 10 minut při 13 000 otáčkách za minutu byly supernatanty odstraněny ze sraženin, byl přidán 75% alkohol (500 ul) a ponecháno stát po dobu 5 minut a směs byla odstřeďována po dobu 10 minut při 13 000 otáčkách za minutu. Alkohol byl poté odstraněn. Dále byl k peletě přidán 100% alkohol (500 ul). Směs byla ponechána stát 5 minut a následně centrifugována 10 minut při 13 000 ot./min. Nakonec byl alkohol ze zkumavky vylit a centrifugační zkumavka byla umístěna dnem vzhůru, aby se mohl veškerý zbývající alkohol odpařit. Nakonec byly precipitáty DNA rozpuštěny za použití vhodného množství sterilizované vody, umístěny do sušárny při 55 °C na 5 minut a skladovány při -20 °C. Obecně platí, že vzorky DNA s poměrem OD260/OD280 1,4 nebo vyšším. Koncentrace získané DNA byla vypočtena na základě koncentrace 50 ug/ml při OD260 = 1,00, která byla určena jako vhodná pro odhad TOBC každého vzorku po kvantifikaci DNA. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) byl použit jako referenční kmen pro odhad křivky růstu bakterií. Po kultivaci přes noc byl bakteriální roztok pětkrát sériově zředěn, aby se vytvořily vzorky s různými koncentracemi S. aureus. Bylo odebráno celkem 10 ul každého ze vzorků a rozprostřeno na agarové médium, aby se dosáhlo koncentrací 2,5 x 103 až 3,9 x 107 CFU/ml. Pro extrakci bakteriální DNA byl odebrán objem 1 ml každé různé bakteriální koncentrace. Extrahovaná bakteriální genomická DNA byla skladována zmrazená při -80 °C, dokud nebyl proveden test RT-PCR. Před testem RT-PCR byla změřena koncentrace bakteriální genomové DNA. Testy RT-PCR detekují hlavně 16S rRNA a ke stanovení standardní křivky koncentrace S. aureus byl použit systém StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Použité sekvence přímého primeru a reverzního primeru byly 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' a 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3', v daném pořadí. Míra pokrytí vybraným párem přímých a reverzních primerů pro běžné bakteriální druhy je 94,9 % a 92,8 %.16 Celkový objem PCR byl 25 ul, zahrnující 5,5 ul ddH20, 1,0 ul 5-uM preprimeru, 1,0 ul 5-uM reverzního primeru, 12,5 ul roztoku SYBR a 5,0 ul (0,25 ug) DNA. Reakční podmínky RT-PCR byly následující: 94 °C po dobu 10 minut; následovaných 35 cykly 95 °C po dobu 45 sekund, 58 °C po dobu 40 sekund a 72 °C po dobu 60 sekund; a následuje jeden cyklus 72 °C po dobu 7 minut. K výpočtu bakteriální koncentrace v každém vzorku slin byla použita regresní rovnice odvozená ze standardní křivky a výsledků RT-PCR. Test RT-PCR byl proveden ve dvou duplikátech pro každý vzorek a variační koeficient prahové hodnoty se měnil mezi 2 % a 12 %. Lidská krevní DNA byla použita jako negativní kontrolní skupina.

Antibakteriální aktivita roztoku ústní vody: Čistě kultivovaný S. aureus použitý jako standardní kmen byl nanesen na kultivační misku (10 cm v průměru) obsahující 1,5 % (g/l) luria bujónového agaru a kultivován přes noc. Byla vybrána jedna kolonie a umístěna do kónické baňky obsahující živnou kapalinu LB, třepána a rekultivována přes noc a výsledný roztok byl sériově zředěn a potažen na destičku, aby se vypočítal počet bakterií na jednotku objemu. Nakonec bylo použito komerční činidlo Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) pro hodnocení antibakteriálního účinku ústní vody. Každý experiment byl proveden duplicitně. Roztoky obsahující různé jednotky tvořící kolonie (0, 10, 100, 1000, 10 000, 1 000 000 a 1 000 000) S. aureus byly centrifugovány při 2000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut, aby se bakterie zkoncentrovaly; po odstranění kapaliny bylo přidáno 180 ul čerstvého kultivačního média pro suspendování bakterií v kultivačním médiu. Bakteriální roztok byl přenesen na 96-jamkovou destičku. Pro vyhodnocení antibakteriálního účinku ústní vody bylo ke směsi bakteriálního roztoku přidáno 20 ul ústní vody. Směs byla inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin. Nakonec bylo přidáno 10 ul činidla CCK-8 a dobře promícháno. Výsledná směs byla inkubována při 37 °C po dobu 2 hodin a absorbance při 450 nm byla měřena pomocí čtečky ELISA. Standardní růstová křivka mohla být vytvořena pro odhad počtu bakterií ve směsi a jejich míry přežití bakterií, které byly poté porovnány se standardní křivkou.

Statistická analýza: Po dokončení sběru dat a kontroly byly dokončené laděné soubory přeneseny do počítače se statistickým softwarem pro statistickou analýzu. Použité popisné statistiky zahrnovaly tabulky rozdělení četností, procenta, průměry a standardní odchylky. V analýze TOBC byly kromě deskriptivní statistiky provedeny t test, chí-kvadrát test a lineární regresní analýza, aby se vyhodnotily a porovnaly změny v počtu bakterií ve slinách účastníků po období intervence. Vzhledem k malé velikosti vzorku a distribuci TOBC byly pro analýzu použity neparametrické statistické metody. Wilcoxonův rank-sum test byl použit k identifikaci rozdílů v numerických datech intervenční skupiny a kontrolní skupiny, Wilcoxonův znaménkový test byl použit k identifikaci změn v numerických datech mezi výchozí a postintervencí a Kruskal- Wallisův test a post hoc Tukey test byly použity k identifikaci rozdílů v numerických datech tří nebo více skupin.