Płyn do płukania jamy ustnej z kwasem podchlorawym, bakterie jamy ustnej i Staphylococcus aureus

Ostatecznie do niniejszego badania zrekrutowano 83 osoby. W sumie 53 pacjentów z chorobą przyzębia zdiagnozowaną przez periodontologa, którzy zostali losowo przydzieleni do grupy stosującej wyłącznie płyn do płukania jamy ustnej (26 pacjentów) lub do grupy stosującej płyn do płukania jamy ustnej i nić dentystyczną (27 pacjentów). Do niniejszego badania zrekrutowano 30 osób kontrolnych. Do określenia liczby bakterii w jamie ustnej zastosowano łańcuchową reakcję polimerazy w czasie rzeczywistym i czysty szczep Staphylococcus aureus z seryjnymi rozcieńczeniami, aby stworzyć standaryzowaną krzywą wzrostu do oszacowania liczby bakterii w jamie ustnej w ślinie. Przed interwencją uczestnicy zostali poproszeni o wypłukanie 5 ml wody w celu usunięcia resztek jedzenia i innych pozostałości w jamie ustnej. Interwencję poproszono uczestników o płukanie jamy ustnej 15 ml płynu do płukania jamy ustnej lub wody przez 5 minut.

Uczestników zapytano o ich historię zdrowia i stosowanie narzędzi do czyszczenia zębów. Uczestnicy przeszli odpowiednie badania stanu jamy ustnej, rejestrowano również ich wskaźniki stanu zdrowia jamy ustnej. Płynem do płukania ust stosowanym do interwencji w niniejszym badaniu było 15 ml dostępnego w handlu płynu do płukania ust La Chlogen (patent Republiki Chińskiej nr M616466) na 5 minut. Głównym składnikiem płynu do płukania jamy ustnej jest HOCl o niskim stężeniu i wysokiej czystości (100 ppm). Roztwory HOCl można również stosować w połączeniu z flosserem do przyzębia La Chlogen (patent Republiki Chińskiej nr M590033). Osobom kontrolnym polecono płukanie gardła czystą wodą (15 ml) przez 5 minut. Każdy uczestnik przeszedł najpierw test wstępny, w którym po pobraniu próbek śliny uczestników zmierzono ich całkowitą liczbę bakterii w jamie ustnej (TOBC). Następnie każdy uczestnik przepłukał usta przydzielonym płynem (płyn do płukania jamy ustnej, płyn do płukania jamy ustnej plus nić dentystyczna lub woda) bez plucia. Po 5 minutach uczestnicy wypluwali płyn, a te próbki śliny zostały zebrane i przetestowane w celu określenia TOBC.

Każdy uczestnik przeszedł dwie sesje pobierania próbki śliny: pretest i posttest. Przed pobraniem śliny badany spłukiwał 5 ml wody. Następnie uczestnicy zostali poproszeni o odkrztuszanie przez maksymalnie 3 minuty do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Tajwan) w celu pobrania niestymulowanej całej śliny. Pobraną próbkę następnie natychmiast umieszczono w przenośnej lodówce do przechowywania i zwrócono do laboratorium w celu ekstrakcji bakteryjnego DNA tego samego dnia. Objętość i wagę śliny każdej próbki rejestrowano również przed procesem ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA.

Analiza TOBC: Po ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA zastosowano technikę reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) do ilościowego określenia całkowitej liczby bakterii jamy ustnej w próbkach śliny. Próbkę śliny wirowano przy 2500 obr./min przez 5 minut. Osad zawieszono w 300 ul roztworu lizozymu (2,5 mg/ml). Po równomiernym wymieszaniu mieszaninę przeniesiono do 1,5 ml probówki Eppendorfa i umieszczono na lodzie na 1 godzinę. Następnie do każdej probówki dodano kolejno 10% SDS (20 ul), 0,5 M EDTA (80 ul) i 20 mg/ml proteinazy K (10 ul); zawartość każdej probówki równomiernie wymieszano i umieszczono w piecu o temperaturze 55°C na noc. Następnie do mieszaniny dodano 10 M NH4OAC w równej objętości. Mieszaninę umieszczono na lodzie na 5 minut i wirowano przy 13 000 obr./min przez 10 minut. Powstały supernatant umieszczono w 1,5 ml probówce do wirowania. Do otrzymanej mieszaniny dodano izopropanol w równej objętości i mieszaninę przechowywano w -20°C przez noc lub -80°C przez 1 godzinę. Po wirowaniu przez 10 minut przy 13 000 obr./min, supernatanty usunięto z osadów, dodano 75% alkohol (500 ul) i pozostawiono na 5 minut, po czym mieszaninę wirowano przez 10 minut przy 13 000 obr./min. Następnie alkohol usunięto. Następnie do peletki dodano 100% alkohol (500 ul). Mieszaninę pozostawiono na 5 minut, a następnie wirowano przez 10 minut przy 13 000 obr./min. Na koniec wylano alkohol z probówki, a probówkę wirówkową umieszczono do góry dnem, aby umożliwić odparowanie pozostałego alkoholu. Na koniec osady DNA rozpuszczono stosując odpowiednią ilość sterylizowanej wody, umieszczono w piecu w temperaturze 55°C na 5 minut i przechowywano w temperaturze -20°C. Ogólnie rzecz biorąc, próbki DNA o stosunku OD260/OD280 równym 1,4 lub wyższym. Stężenie odzyskanego DNA obliczono na podstawie stężenia 50 µg/ml przy OD260 = 1,00, które uznano za odpowiednie do oszacowania TOBC każdej próbki po oznaczeniu ilościowym DNA. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) zastosowano jako szczep referencyjny w ocenie krzywej wzrostu bakterii. Po całonocnej hodowli roztwór bakteryjny rozcieńczano seryjnie pięć razy w celu uzyskania próbek o różnych stężeniach S. aureus. Pobrano łącznie 10 µl każdej z próbek i rozprowadzono je na podłożu agarowym w celu uzyskania stężenia od 2,5 × 103 do 3,9 × 107 CFU/mL. Do ekstrakcji bakteryjnego DNA pobrano objętość 1 ml każdego z różnych stężeń bakterii. Wyekstrahowany bakteryjny genomowy DNA przechowywano zamrożony w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia testu RT-PCR. Przed wykonaniem testu RT-PCR zmierzono stężenie genomowego DNA bakterii. Testy RT-PCR wykrywają głównie 16S rRNA, a do ustalenia krzywej standardowej stężenia S. aureus zastosowano system StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Zastosowane sekwencje startera przedniego i startera wstecznego to odpowiednio 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' i 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3'.16 Wskaźniki pokrycia wybranych par starterów do przodu i do tyłu dla pospolitych gatunków bakterii wynoszą odpowiednio 94,9% i 92,8%.16 Całkowita objętość PCR wynosiła 25 µl i zawierała 5,5 µl ddH2O, 1,0 µl 5-µM preprimera, 1,0 µl 5-µM startera odwrotnego, 12,5 µl roztworu SYBR i 5,0 µl (0,25 µg) DNA. Warunki reakcji RT-PCR były następujące: 94°C przez 10 minut; następnie 35 cykli 95°C przez 45 sekund, 58°C przez 40 sekund i 72°C przez 60 sekund; a następnie jeden cykl w temperaturze 72°C przez 7 minut. Równanie regresji wyprowadzone z krzywej standardowej i wyniki RT-PCR wykorzystano do obliczenia stężenia bakterii w każdej próbce śliny. Test RT-PCR przeprowadzono w dwóch powtórzeniach dla każdej próbki, a współczynnik zmienności progu wahał się między 2% a 12%. DNA z ludzkiej krwi zastosowano jako negatywną grupę kontrolną.

Aktywność przeciwbakteryjna roztworu do płukania jamy ustnej: Czystą hodowlę S. aureus stosowaną jako szczep standardowy wysiano na płytkę hodowlaną (o średnicy 10 cm) zawierającą 1,5% (g/l) agaru bulionowego Luria i hodowano przez noc. Pojedynczą kolonię wybrano i umieszczono w kolbie stożkowej zawierającej płynną pożywkę LB, wytrząsano i ponownie hodowano przez noc, a uzyskany roztwór rozcieńczano seryjnie i powlekano płytkę w celu obliczenia liczby bakterii na jednostkę objętości. Na koniec, do oceny przeciwbakteryjnego działania płynu do płukania jamy ustnej użyto dostępnego w handlu odczynnika Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem). Każdy eksperyment przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Roztwory zawierające różne jednostki tworzące kolonie (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 i 1000000) S. aureus wirowano przy 2000 obr./min przez 5 minut w celu zatężenia bakterii; po usunięciu cieczy dodano 180 µl świeżej pożywki hodowlanej w celu zawieszenia bakterii w pożywce hodowlanej. Roztwór bakterii przeniesiono na 96-studzienkową płytkę. Aby ocenić przeciwbakteryjne działanie płynu do płukania ust, do mieszaniny roztworu bakteryjnego dodano 20 µl płynu do płukania ust. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Na koniec dodano 10 µl odczynnika CCK-8 i dobrze wymieszano. Otrzymaną mieszaninę inkubowano w 37°C przez 2 godziny i zmierzono absorbancję przy 450 nm stosując czytnik ELISA. Standardową krzywą wzrostu można było wyznaczyć do oszacowania liczby bakterii w mieszaninie i wskaźnika przeżywalności bakterii, które następnie porównano z krzywą standardową.

Analiza statystyczna: Po zakończeniu zbierania i sprawdzania danych sfinalizowane debugowane pliki zostały przeniesione do komputera z oprogramowaniem statystycznym do analizy statystycznej. Zastosowane statystyki opisowe obejmowały tabele rozkładu częstości, wartości procentowe, średnie i odchylenia standardowe. W analizie TOBC, oprócz statystyk opisowych, przeprowadzono test t, test chi-kwadrat i analizę regresji liniowej w celu oceny i porównania zmian liczby bakterii w ślinie uczestników po okresie interwencji. Ze względu na małą liczebność próby i rozkład TOBC do analizy wykorzystano nieparametryczne metody statystyczne. Test sumy rang Wilcoxona został wykorzystany do zidentyfikowania różnic w danych liczbowych grupy interwencyjnej i grupy kontrolnej, test rang ze znakiem Wilcoxona został użyty do zidentyfikowania zmian danych liczbowych między wartością wyjściową i po interwencji, a Kruskala- Do zidentyfikowania różnic w danych liczbowych trzech lub więcej grup zastosowano test Wallisa i test post hoc Tukeya.