Хлорноватистая кислота для полоскания рта, оральные бактерии и золотистый стафилококк

Наконец, в настоящее исследование было включено 83 человека. В общей сложности 53 пациента с заболеванием пародонта, диагностированным пародонтологом, были случайным образом распределены в группу, получавшую только жидкость для полоскания рта (26 пациентов) или группу жидкости для полоскания рта плюс пародонтальную нить (27 пациентов). В настоящее исследование было включено 30 человек из контрольной группы. Для определения количества бактерий в ротовой полости применяли полимеразную цепную реакцию в реальном времени и чистый штамм Staphylococcus aureus с серийными разведениями, чтобы создать стандартизированную кривую роста для оценки количества бактерий в ротовой полости в слюне. Перед вмешательством участников попросили прополоскать рот 5 мл воды, чтобы избавиться от остатков пищи и других остатков во рту. Участникам вмешательства было предложено полоскать полость рта 15 мл жидкости для полоскания рта или водой в течение 5 минут.

Участников спросили об их истории здоровья и использовании инструментов для чистки зубов. Участники прошли соответствующие осмотры полости рта, а также были зарегистрированы их индексы здоровья полости рта. Жидкость для полоскания рта, используемая для вмешательства в настоящем исследовании, представляла собой 15 мл коммерчески доступной жидкости для полоскания рта La Chlogen (патент Китайской Республики № M616466) на 5 минут. Основным ингредиентом жидкости для полоскания рта является низкоконцентрированная HOCl высокой чистоты (100 частей на миллион). Растворы HOCl можно также использовать в сочетании с пародонтальной нитью La Chlogen (патент Китайской Республики № M590033). Контролям давали указание полоскать горло чистой водой (15 мл) в течение 5 минут. Каждый участник сначала прошел предварительное тестирование, в ходе которого после сбора образцов слюны участников измеряли их общее количество бактерий в ротовой полости (TOBC). После этого каждый участник прополоскал рот назначенной ему жидкостью (ополаскиватель для рта, жидкость для полоскания рта плюс пародонтальная нить или вода), не сплевывая. Через 5 минут участники выплюнули жидкость, и эти образцы слюны были собраны и протестированы для определения TOBC.

Каждый участник прошел два сеанса сбора образцов слюны: претест и посттест. Перед сбором слюны участника ополаскивают 5 мл воды. После этого участников просили отхаркивать в течение максимум 3 минут в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл (Creative Biotechnology Co., Ltd., Тайвань) для сбора цельной нестимулированной слюны. Затем собранный образец немедленно помещали в портативный холодильник для хранения и возвращали в лабораторию для экстракции бактериальной ДНК в тот же день. Объем слюны и вес каждого образца также регистрировали перед процессом экстракции бактериальной геномной ДНК.

Анализ TOBC: после выделения бактериальной геномной ДНК методы полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCR) использовались для количественного определения общего количества бактерий полости рта в образцах слюны. Образец слюны центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 минут. Осадок суспендировали в 300 мкл раствора лизоцима (2,5 мг/мл). После равномерного перемешивания смесь переносили в пробирку Эппендорф на 1,5 мл и помещали на лед на 1 час. После этого в каждую пробирку последовательно добавляли 10% SDS (20 мкл), 0,5 М ЭДТА (80 мкл) и 20 мг/мл протеиназы К (10 мкл); содержимое каждой пробирки равномерно перемешивали и помещали в печь при 55°С на ночь. Затем к смеси добавляли 10 М NH4OAC в равных объемах. Смесь помещали на лед на 5 минут и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут. Полученный супернатант помещали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. К полученной смеси добавляли изопропанол в равных объемах и смесь выдерживали при -20°С в течение ночи или при -80°С в течение 1 часа. После центрифугирования в течение 10 минут при 13000 об/мин супернатанты отделяли от осадков, добавляли 75% спирт (500 мкл) и оставляли на 5 минут, после чего смесь центрифугировали в течение 10 минут при 13000 об/мин. Затем алкоголь был удален. Затем к осадку добавляли 100% спирт (500 мкл). Смесь оставляли стоять на 5 минут и затем центрифугировали в течение 10 минут при 13000 об/мин. Наконец, спирт из пробирки выливали, а центрифужную пробирку переворачивали вверх дном, чтобы дать испариться остаткам спирта. Наконец, осадки ДНК растворяли в соответствующем количестве стерилизованной воды, помещали в печь при 55°С на 5 минут и хранили при -20°С. Как правило, образцы ДНК с соотношением OD260/OD280 1,4 или выше. Концентрацию извлеченной ДНК рассчитывали на основе концентрации 50 мкг/мл при OD260 = 1,00, которая была определена как подходящая для оценки TOBC каждого образца после количественного определения ДНК. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) использовали в качестве эталонного штамма при оценке кривой роста бактерий. После культивирования в течение ночи бактериальный раствор последовательно разбавляли в пять раз для получения образцов с различными концентрациями S. aureus. Всего было взято 10 мкл каждого из образцов и нанесено на агаровую среду для достижения концентрации от 2,5×103 до 3,9×107 КОЕ/мл. Для экстракции бактериальной ДНК брали по 1 мл каждой разной концентрации бактерий. Экстрагированную бактериальную геномную ДНК хранили в замороженном виде при -80°C до проведения теста ОТ-ПЦР. Перед тестом ОТ-ПЦР измеряли концентрацию бактериальной геномной ДНК. Тесты ОТ-ПЦР в основном выявляют 16S рРНК, и для построения стандартной кривой концентрации S. aureus использовали систему StepOnePlus (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Используемые последовательности прямого праймера и обратного праймера были следующими: 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' и 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3' соответственно.16 Степень покрытия выбранной парой прямых и обратных праймеров для обычных видов бактерий составляет 94,9% и 92,8% соответственно.16 Общий объем ПЦР составил 25 мкл, включая 5,5 мкл ddH2O, 1,0 мкл 5-мкМ препраймера, 1,0 мкл 5-мкМ обратного праймера, 12,5 мкл раствора SYBR и 5,0 мкл (0,25 мкг) ДНК. Условия реакции RT-PCR были следующими: 94°C в течение 10 минут; затем 35 циклов 95°С в течение 45 секунд, 58°С в течение 40 секунд и 72°С в течение 60 секунд; и затем один цикл при 72°С в течение 7 минут. Уравнение регрессии, полученное из стандартной кривой и результатов ОТ-ПЦР, использовали для расчета концентрации бактерий в каждом образце слюны. Анализ ОТ-ПЦР проводили в двух повторах для каждого образца, а коэффициент вариации порога варьировал от 2% до 12%. В качестве группы отрицательного контроля использовали ДНК крови человека.

Антибактериальная активность раствора для полоскания рта. Чистую культуру S. aureus, используемую в качестве стандартного штамма, высевали на чашку для культивирования (диаметром 10 см), содержащую 1,5% (г/л) бульонного агара с лурией, и культивировали в течение ночи. Отбирали одну колонию и помещали в коническую колбу, содержащую питательную жидкость LB, встряхивали и повторно культивировали в течение ночи, а полученный раствор серийно разбавляли и наносили на планшет для расчета количества бактерий на единицу объема. Наконец, для оценки антибактериального эффекта жидкости для полоскания рта использовали коммерческий реагент Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem). Каждый эксперимент проводили в двух экземплярах. Растворы, содержащие различные колониеобразующие единицы (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 и 1000000) S. aureus, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 минут для концентрирования бактерий; после удаления жидкости добавляли 180 мкл свежей культуральной среды, чтобы суспендировать бактерии в культуральной среде. Раствор бактерий переносили на 96-луночный планшет. Для оценки антибактериального действия ополаскивателя к смеси бактериального раствора добавляли 20 мкл ополаскивателя. Смесь инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Наконец, добавляли 10 мкл реагента CCK-8 и хорошо перемешивали. Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 2 часов и измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием считывателя ELISA. Стандартную кривую роста можно было установить для оценки количества бактерий в смеси и их выживаемости бактерий, которые затем сравнивали со стандартной кривой.

Статистический анализ: После того, как сбор и проверка данных были завершены, окончательные отлаженные файлы были переданы на компьютер со статистическим программным обеспечением для статистического анализа. Используемая описательная статистика включала таблицы распределения частот, проценты, средние значения и стандартные отклонения. В анализе TOBC, в дополнение к описательной статистике, были проведены t-критерий, критерий хи-квадрат и линейный регрессионный анализ для оценки и сравнения изменений количества бактерий в слюне участников после периода вмешательства. Учитывая небольшой размер выборки и распределение ООБК, для анализа использовали непараметрические статистические методы. Критерий суммы рангов Уилкоксона использовался для выявления различий в числовых данных группы вмешательства и контрольной группы, критерий знакового ранга Вилкоксона использовался для выявления изменений в числовых данных между исходным уровнем и после вмешательства, а критерий Крускала- Критерий Уоллиса и апостериорный тест Тьюки использовали для выявления различий в числовых данных трех и более групп.