Enxaguante bucal com ácido hipocloroso, bactérias orais e Staphylococcus aureus

Finalmente, 83 pessoas foram recrutadas para o presente estudo. Um total de 53 pacientes com doença periodontal diagnosticada por um periodontista, que foram aleatoriamente designados para o grupo somente de enxaguatório bucal (26 pacientes) ou o grupo de enxaguatório bucal mais fio dental periodontal (27 pacientes). Foram recrutados 30 controles para o presente estudo. Para a determinação das contagens bacterianas orais, uma reação em cadeia da polimerase em tempo real e uma cepa pura de Staphylococcus aureus com diluições seriadas foram aplicadas para criar uma curva de crescimento padronizada para a estimativa das contagens bacterianas orais na saliva. Antes da intervenção, os participantes foram solicitados a enxaguar 5 ml de água para esgotar os restos de comida e outros resíduos na boca. A intervenção foi solicitada aos participantes para enxaguar os 15 ml de enxaguatório bucal ou água por 5 minutos na cavidade oral.

Os participantes foram questionados sobre seu histórico de saúde e uso de utensílios de limpeza dental. Os participantes foram submetidos a exames de saúde bucal relevantes, e seus índices de saúde bucal também foram registrados. O colutório usado para intervenção no presente estudo foi 15 mL de colutório comercialmente disponível La Chlogen (República da China Patente No. M616466) por 5 minutos. O principal ingrediente do enxaguante bucal é o HOCl de baixa concentração e alta pureza (100 ppm). As soluções HOCl também podem ser usadas em conjunto com o fio dental La Chlogen (Patente da República da China nº M590033). Os controles foram instruídos a gargarejar com água pura (15 ml) por 5 minutos. Cada participante passou primeiro por um pré-teste, no qual, após a coleta das amostras de saliva dos participantes, sua contagem bacteriana oral total (TOBC) foi medida. Em seguida, cada participante enxaguou a boca com o líquido designado (colutório, enxaguatório bucal mais fio dental periodontal ou água) sem cuspir. Após 5 minutos, os participantes cuspiram o líquido e essas amostras de saliva foram coletadas e testadas para determinar o TOBC.

Cada participante foi submetido a duas sessões de coleta de amostras de saliva: pré-teste e pós-teste. Antes da coleta de saliva, o participante enxaguou com 5 ml de água. Depois disso, os participantes foram solicitados a expectorar por um período máximo de 3 minutos em um tubo de centrifugação estéril de 50 ml (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) para a coleta de saliva total não estimulada. O espécime coletado foi imediatamente colocado em uma caixa de gelo portátil para armazenamento, devolvido ao laboratório para a extração do DNA bacteriano no mesmo dia. O volume e o peso da saliva de cada amostra também foram registrados antes do processo de extração do DNA genômico bacteriano.

Análise TOBC: Após a extração do DNA genômico bacteriano, as técnicas de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) foram usadas para quantificar as contagens totais de bactérias orais nas amostras de saliva. A amostra de saliva foi centrifugada a 2500 rpm por 5 minutos. O sedimento foi suspenso com 300 µl de solução de lisozima (2,5 mg/mL). Depois de homogeneizada, a mistura foi transferida para um tubo eppendorf de 1,5mL e colocada no gelo por 1 hora. Em seguida, SDS 10% (20µL), EDTA 0,5M (80µL) e proteinase K 20mg/mL (10µL) foram adicionados a cada tubo em sequência; o conteúdo de cada tubo foi misturado uniformemente e colocado em um forno a 55°C durante a noite. Em seguida, 10M NH4OAC foi adicionado à mistura em igual volume. A mistura foi colocada no gelo por 5 minutos e centrifugada a 13.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante resultante foi colocado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Isopropanol foi adicionado à mistura resultante em igual volume, e a mistura foi armazenada a -20°C durante a noite ou -80°C durante 1 hora. Após centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm, os sobrenadantes foram retirados dos precipitados, adicionado álcool 75% (500µL) e deixado em repouso por 5 minutos, sendo a mistura centrifugada por 10 minutos a 13.000 rpm. O álcool foi então removido. Em seguida, álcool 100% (500µL) foi adicionado ao pellet. A mistura foi deixada em repouso por 5 minutos e posteriormente centrifugada por 10 minutos a 13.000 rpm. Por fim, o álcool no tubo foi despejado e o tubo da centrífuga foi colocado de cabeça para baixo para permitir a evaporação do álcool restante. Finalmente, os precipitados de DNA foram dissolvidos usando uma quantidade apropriada de água esterilizada, colocados em estufa a 55°C por 5 minutos e armazenados a -20°C. Geralmente, as amostras de DNA com uma razão OD260/OD280 de 1,4 ou superior. A concentração de DNA recuperado foi calculada com base em uma concentração de 50 µg/mL em OD260 = 1,00, que foi determinada como adequada para estimar o TOBC de cada amostra após a quantificação do DNA. Staphylococcus aureus (ATCC 29213) foi usado como cepa de referência na estimativa da curva de crescimento bacteriano. Após cultura durante a noite, a solução bacteriana foi diluída em série cinco vezes para gerar espécimes com diferentes concentrações de S. aureus. Um total de 10 µL de cada um dos espécimes foram retirados e espalhados no meio de ágar para atingir concentrações de 2,5 × 103 a 3,9 × 107 UFC/mL. Um volume de 1 mL de cada concentração bacteriana diferente foi levado para extração de DNA bacteriano. O DNA genômico bacteriano extraído foi armazenado congelado a -80°C até a realização do teste de RT-PCR. Antes do teste de RT-PCR, foi medida a concentração de DNA genômico bacteriano. Os testes de RT-PCR detectam principalmente 16S rRNA, e um sistema StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi usado para estabelecer uma curva padrão de concentração de S. aureus. A sequência do primer direto e do primer reverso usados ​​foram 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' e 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3', respectivamente.16 As taxas de cobertura do par de primers direto e reverso selecionados para espécies bacterianas comuns são 94,9% e 92,8%, respectivamente.16 O volume total de PCR foi de 25 uL, compreendendo 5,5 µL de ddH2O, 1,0 µL de pré-iniciador 5 µM, 1,0 µL de primer reverso 5 µM, 12,5 µL de solução SYBR e 5,0 µL (0,25 µg) de DNA. As condições da reação de RT-PCR foram as seguintes: 94°C por 10 minutos; seguido de 35 ciclos de 95°C por 45 segundos, 58°C por 40 segundos e 72°C por 60 segundos; e seguido por um ciclo de 72°C por 7 minutos. Uma equação de regressão derivada da curva padrão e os resultados de RT-PCR foram usados ​​para calcular a concentração bacteriana em cada amostra de saliva. O ensaio de RT-PCR foi realizado em duas duplicatas para cada amostra, e o coeficiente de variação do limiar variou entre 2% e 12%. DNA de sangue humano foi usado como um grupo de controle negativo.

Atividade antibacteriana da solução para enxaguatório bucal: O S. aureus cultivado puro usado como cepa padrão foi semeado em uma placa de cultura (10 cm de diâmetro) contendo 1,5% (g/L) de caldo luria ágar e cultivado durante a noite. Uma única colônia foi selecionada e colocada em um frasco cônico contendo líquido nutriente LB, agitado e recultivado durante a noite, e a solução resultante foi diluída em série e revestida na placa para calcular o número de bactérias por unidade de volume. Finalmente, um reagente comercial Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) foi usado para avaliar o efeito antibacteriano do enxaguatório bucal. Cada experimento foi realizado em duplicata. Soluções contendo diferentes unidades formadoras de colônias (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 e 1000000) de S. aureus foram centrifugadas a 2000 rpm por 5 minutos para concentrar as bactérias; após a retirada do líquido, foram adicionados 180 µL de meio de cultura fresco para suspender as bactérias no meio de cultura. A solução bacteriana foi transferida para uma placa de 96 poços. Para avaliar o efeito antibacteriano do enxaguatório bucal, 20 µL do enxaguatório bucal foram adicionados à mistura da solução bacteriana. A mistura foi incubada a 37°C por 2 horas. Finalmente, 10 µL de reagente CCK-8 foram adicionados e bem misturados. A mistura resultante foi incubada a 37°C por 2 horas e a absorbância a 450 nm foi medida usando um leitor de ELISA. A curva de crescimento padrão pôde ser estabelecida para a estimativa do número de bactérias na mistura e sua taxa de sobrevivência das bactérias, que foram então comparadas com a curva padrão.

Análise estatística: Após a conclusão da coleta e verificação dos dados, os arquivos depurados finalizados foram transferidos para um computador com software estatístico para análise estatística. A estatística descritiva utilizada incluiu tabelas de distribuição de frequência, porcentagens, médias e desvios-padrão. Na análise TOBC, além da estatística descritiva, foram realizados teste t, teste qui-quadrado e análise de regressão linear para avaliar e comparar as mudanças nas contagens bacterianas da saliva dos participantes após o período de intervenção. Considerando o pequeno tamanho da amostra e a distribuição do TOBC, métodos estatísticos não paramétricos foram usados ​​para análise. O teste de Wilcoxon rank-sum foi usado para identificar diferenças nos dados numéricos do grupo de intervenção e do grupo controle, o teste de postos sinalizados de Wilcoxon foi usado para identificar mudanças nos dados numéricos entre a linha de base e pós-intervenção, e o Kruskal- O teste de Wallis e o teste post hoc de Tukey foram usados ​​para identificar diferenças nos dados numéricos de três ou mais grupos.