Hypokloorihappo suuvesi, suun bakteerit ja Staphylococcus aureus

Lopulta tähän tutkimukseen rekrytoitiin 83 henkilöä. Yhteensä 53 potilasta, joilla oli periodonttilääkärin diagnosoima parodontaalisairaus ja jotka jaettiin satunnaisesti pelkän suuveden ryhmään (26 potilasta) tai suuveden ja hammaslangan ryhmään (27 potilasta). Tähän tutkimukseen rekrytoitiin 30 kontrollia. Suun bakteerimäärän määrittämiseksi käytettiin reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiota ja puhdasta Staphylococcus aureus -kantaa sarjalaimennoksilla, jotta luotiin standardoitu kasvukäyrä syljen suun bakteerimäärän arvioimiseksi. Ennen interventiota osallistujia pyydettiin huuhtelemaan 5 ml vettä ruokajätteiden ja muiden suussa olevien jäämien poistamiseksi. Intervention osallistujia pyydettiin huuhtelemaan 15 ml:n suuvettä tai vettä 5 minuutin ajan suuontelossa.

Osallistujilta kysyttiin heidän terveyshistoriaansa ja hampaiden puhdistusvälineiden käyttöä. Osallistujille tehtiin asiaankuuluvat suun terveystarkastukset, ja myös heidän suun terveysindeksinsä kirjattiin. Tässä tutkimuksessa interventioon käytetty suuvesi oli 15 ml kaupallisesti saatavilla olevaa La Chlogen -suuvettä (Kiinan tasavallan patentti nro M616466) 5 minuutin ajan. Suuveden pääainesosa on matalapitoinen erittäin puhdas HOCl (100 ppm). HOCl-liuoksia voidaan käyttää myös La Chlogen parodontaalilangan (Kiinan tasavallan patentti nro M590033) kanssa. Kontrolleja käskettiin kurlaamaan puhtaalla vedellä (15 ml) 5 minuutin ajan. Jokaiselle osallistujalle tehtiin ensin esitesti, jossa osallistujien sylkinäytteen ottamisen jälkeen mitattiin heidän kokonaisbakteerimääränsä (TOBC). Sen jälkeen jokainen osallistuja huuhteli suunsa sille määrätyllä nesteellä (suuvesi, suuvesi sekä periodontaalinen hammaslanka tai vesi) sylkemättä. Viiden minuutin kuluttua osallistujat sylkivät nesteen, ja nämä sylkinäytteet kerättiin ja testattiin TOBC:n määrittämiseksi.

Jokaiselle osallistujalle tehtiin kaksi sylkinäytteenottoa: esitesti ja jälkitesti. Ennen syljen keräämistä osallistuja huuhdeltiin 5 ml:lla vettä. Tämän jälkeen osallistujia pyydettiin yskäämään enintään 3 minuutin ajan 50 ml:n steriiliin sentrifugointiputkeen (Creative Biotechnology Co., Ltd., Taiwan) stimuloimattoman kokonaisen syljen keräämiseksi. Kerätty näyte asetettiin sitten välittömästi kannettavaan jäälaatikkoon säilytystä varten ja palautettiin laboratorioon saman päivän bakteeri-DNA:n uuttamista varten. Jokaisen näytteen syljen tilavuus ja paino rekisteröitiin myös ennen bakteerien genomisen DNA:n uuttamisprosessia.

TOBC-analyysi: Bakteerien genomisen DNA:n uuttamisen jälkeen käytettiin reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiotekniikkaa (RT-PCR) määrittämään suun bakteerien kokonaismäärä sylkinäytteissä. Sylkinäytettä sentrifugoitiin nopeudella 2500 rpm 5 minuuttia. Pelletti suspendoitiin 300 ul:aan lysotsyymiliuosta (2,5 mg/ml). Tasaisen sekoituksen jälkeen seos siirrettiin 1,5 ml:n eppendorf-putkeen ja asetettiin jäille 1 tunniksi. Sen jälkeen kuhunkin putkeen lisättiin peräkkäin 10 % SDS:ää (20 ui), 0,5 M EDTA:ta (80 ui) ja 20 mg/ml proteinaasi K:tä (10 ui); kunkin putken sisältö sekoitettiin tasaisesti ja asetettiin 55 °C:seen uuniin yön yli. Seuraavaksi seokseen lisättiin 10 M NH4OAC samassa tilavuudessa. Seos asetettiin jäille 5 minuutiksi ja sentrifugoitiin 13 000 rpm:llä 10 minuuttia. Saatu supernatantti laitettiin 1,5 ml:n sentrifugiputkeen. Saatuun seokseen lisättiin isopropanolia yhtä suurena tilavuutena ja seosta säilytettiin -20 °C:ssa yön yli tai -80 °C:ssa 1 tunti. Kun oli sentrifugoitu 10 minuuttia nopeudella 13 000 rpm, supernatantit poistettiin sakasta, lisättiin 75 % alkoholia (500 ui) ja annettiin seistä 5 minuuttia, ja seosta sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 13 000 rpm. Sen jälkeen alkoholi poistettiin. Seuraavaksi pellettiin lisättiin 100 % alkoholia (500 ui). Seoksen annettiin seistä 5 minuuttia ja sen jälkeen sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 13 000 rpm. Lopuksi putkessa oleva alkoholi kaadettiin ulos ja sentrifugiputki asetettiin ylösalaisin, jotta jäljellä oleva alkoholi haihtui. Lopuksi DNA-sakkauma liuotettiin käyttämällä sopivaa määrää steriloitua vettä, laitettiin uuniin 55 °C:seen 5 minuutiksi ja säilytettiin -20 °C:ssa. Yleensä DNA-näytteet, joiden OD260/OD280-suhde on 1,4 tai suurempi. Talteen otetun DNA:n konsentraatio laskettiin 50 ug/ml:n pitoisuuden perusteella OD260 = 1,00:ssa, joka määritettiin sopivaksi kunkin näytteen TOBC:n arvioimiseen DNA:n kvantifioinnin jälkeen. Staphylococcus aureusta (ATCC 29213) käytettiin vertailukantana bakteerien kasvukäyrän arvioinnissa. Yön yli viljelyn jälkeen bakteeriliuos sarjalaimennettiin viisi kertaa näytteiden muodostamiseksi, joissa oli eri konsentraatioita S. aureus -bakteeria. Yhteensä 10 ui kutakin näytettä otettiin ja levitettiin agar-elatusaineelle, jotta saavutettiin pitoisuudet 2,5 × 103 - 3,9 × 107 CFU/ml. 1 ml:n tilavuus kutakin eri bakteerikonsentraatiota otettiin bakteerien DNA:n uuttamista varten. Uutettua bakteerien genomista DNA:ta säilytettiin pakastettuna -80 °C:ssa, kunnes RT-PCR-testi suoritettiin. Ennen RT-PCR-testiä mitattiin bakteerien genominen DNA-pitoisuus. RT-PCR-testit havaitsevat pääasiassa 16S rRNA:n, ja StepOnePlus-järjestelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käytettiin S. aureus -konsentraation standardikäyrän luomiseen. Käytetyn eteenpäin suunnatun alukkeen ja käänteisen alukkeen sekvenssi oli 5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3' ja 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGTT T-3', vastaavasti.16 Valitun myötä- ja käänteisen alukeparin peittoasteet yleisille bakteerilajeille ovat 94,9 % ja 92,8 %.16 PCR:n kokonaistilavuus oli 25 uL, joka sisälsi 5,5 µl ddH2O:ta, 1,0 µl 5 µM esialuketta, 1,0 µl 5 µM käänteisaluketta, 12,5 µl SYBR-liuosta ja 5,0 µl 5,0 µl DNA:ta. RT-PCR-reaktio-olosuhteet olivat seuraavat: 94 °C 10 minuuttia; sen jälkeen 35 sykliä 95 °C:ssa 45 sekuntia, 58 °C:ssa 40 sekuntia ja 72 °C:ssa 60 sekuntia; ja sen jälkeen yksi sykli 72 °C:ssa 7 minuutin ajan. Kunkin sylkinäytteen bakteeripitoisuuden laskemiseen käytettiin standardikäyrästä johdettua regressioyhtälöä ja RT-PCR-tuloksia. RT-PCR-määritys suoritettiin kaksi kaksoiskappaletta kullekin näytteelle, ja kynnyksen variaatiokerroin vaihteli välillä 2 % - 12 %. Ihmisveren DNA:ta käytettiin negatiivisena kontrolliryhmänä.

Suuvesiliuoksen antibakteerinen aktiivisuus: Standardikannana käytetty puhdasviljelty S. aureus maljattiin viljelylevylle (halkaisijaltaan 10 cm), joka sisälsi 1,5 % (g/l) lurialiemiagaria, ja viljeltiin yön yli. Yksi pesäke valittiin ja asetettiin erlenmeyerpulloon, joka sisälsi LB-ravinnenestettä, ravisteltiin ja viljeltiin uudelleen yön yli, ja tuloksena oleva liuos laimennettiin sarjassa ja päällystettiin levylle bakteerien lukumäärän laskemiseksi tilavuusyksikköä kohti. Lopuksi käytettiin kaupallista Cell Counting Kit 8 (CCK-8, Engreen Biosystem) reagenssia suuveden antibakteerisen vaikutuksen arvioimiseen. Jokainen koe suoritettiin kahtena kappaleena. Liuoksia, jotka sisälsivät erilaisia ​​S. aureuksen pesäkkeitä muodostavia yksiköitä (0, 10, 100, 1000, 10000, 100000 ja 1000000), sentrifugoitiin 2000 rpm:ssä 5 minuuttia bakteerien konsentroimiseksi; nesteen poistamisen jälkeen lisättiin 180 ui tuoretta elatusainetta bakteerien suspendoimiseksi viljelyalustaan. Bakteeriliuos siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle. Suuveden antibakteerisen vaikutuksen arvioimiseksi 20 ui suuvettä lisättiin bakteeriliuoksen seokseen. Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tuntia. Lopuksi lisättiin 10 ui CCK-8-reagenssia ja sekoitettiin hyvin. Saatua seosta inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tuntia, ja absorbanssi 450 nm:ssä mitattiin käyttämällä ELISA-lukijaa. Standardikasvukäyrä voitiin muodostaa seoksessa olevien bakteerien lukumäärän ja niiden bakteerien eloonjäämisasteen arvioimiseksi, joita sitten verrattiin standardikäyrään.

Tilastollinen analyysi: Kun tiedonkeruu ja tarkistus oli suoritettu loppuun, viimeistellyt virheenkorjaustiedostot siirrettiin tietokoneelle, jossa oli tilastollinen ohjelmisto tilastollista analyysiä varten. Käytetyt kuvaavat tilastot sisälsivät frekvenssijakaumataulukot, prosentit, keskiarvot ja keskihajonnan. TOBC-analyysissä tehtiin kuvaavien tilastojen lisäksi t-testi, khin neliötesti ja lineaarinen regressioanalyysi, joilla arvioitiin ja vertailtiin osallistujien syljen bakteerimäärien muutoksia interventiojakson jälkeen. Ottaen huomioon pienen otoksen koon ja TOBC-jakauman, analysoinnissa käytettiin ei-parametrisia tilastollisia menetelmiä. Wilcoxon rank-sum testiä käytettiin tunnistamaan erot interventioryhmän ja kontrolliryhmän numeerisissa tiedoissa, Wilcoxon signed-rank testiä käytettiin tunnistamaan muutoksia numeerisissa tiedoissa lähtötilanteen ja intervention jälkeisen välillä ja Kruskal- Wallis-testiä ja post hoc Tukey-testiä käytettiin tunnistamaan erot kolmen tai useamman ryhmän numeerisissa tiedoissa.